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一种油菜雄性不育恢复基因分子标记的制备方法，其步骤是：A、选取拟南芥1号染色体臂PPR基因AT1G126209, AT1G63070, 萝卜细胞质雄性不育的恢复基因Rf0，从美国国家生物技术信息中心数据库中提取各基因的蛋白质序列，进行多序列比对，在保守氨基酸位点处兼顾简并度最小原则设计间并引物，正向引物序列为TTY GTN AAG GAR GGN AAG CT，反向引物序列为DAT RAG NGT RTT RTA NGT AAC；B、用CTAB法抽取油菜异源细胞质雄性不育恢复系的叶片DNA，采用降落PCR程序进行扩增，PCR扩增体系为：TaqMIX 10µl，DNA模板1µl,正反向引物各2.5µl,ddH2O 4µl，降落 PCR程序为：95℃ 2 min,14个循环，然后95℃ 30 s, 40℃ 45 s,72℃ 2 min,25个循环，PCR扩增产物用2% g/v琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后检测；C、PCR产物回收、转化及测序：使用E.Z.N.A GEL extraction kit试剂盒回收目标片断，用PGEM‑T vecter试剂盒连接后于16℃过夜，转化大肠杆菌DH5感受态细胞，通过篮白斑筛选获得阳性克隆，挑选3‑5个阳性克隆繁殖后，菌液送样测序；D、特异片段DNA序列分析：将从恢复系DNA中扩增得到的特异片段测序，获得长度为309 bp的序列，将特异片段的DNA序列送至NCBI基因序列库进行BLAST检索，获得了三个高度同源的基因序列，其中一个是从具有油菜波里马CMS育性恢复性状的一个白菜型油菜材料中得到的克隆，在该区段上的一致性达85%，是一个1953bp的表达基因序列，编码含有16个PPR基序的蛋白，与拟南芥1号染色体臂上的PPR基因AT1G12300的同源性在70%以上；E、特异片段可能编码的氨基酸序列及蛋白基序分析：使用EBI transeq将此长度为309 bp的片段翻译成蛋白质序列，结果表明该片段编码103个氨基酸残基，将这103个氨基酸序列提交至Smart进行结构域预测，发现其含有两个PPR蛋白基序，各基序为35个氨基酸，属于PPR基因家族的p亚族，其中第一个PPR基序位于27‑61个氨基酸区域，接着第二个位于62‑96个氨基酸区域，两个PPR基序的预测值分别为4.00e‑10和6.60e‑12，将这103个氨基酸序列提交NCBI进行BLAST同源性搜索，获得的同源序列除了拟南芥的PPR基因之外，全部是与植物CMS恢复基因相关的序列，包括萝卜及甘蓝型油菜萝卜质CMS、甘蓝型油菜波里马CMS、水稻CMS和矮牵牛CMS的恢复基因；F、含特异片段的全长cDNA的获得：根据所得的DNA片段设计引物，使用SMART RACE CDNA AMPICATION KIT,分别进行5’RACE与3’RACE，设计的RACE引物序列如下：3’RACE GSP：5’GGCTAAGCAGATGATGGACCTGATGGCTAGCAAGGG3’, 5’RACE GSP: 5’ATGTCCACGAGAGGGGTGGTTGCCAATACA3’；将扩增得到的RACE片段分别回收测序，测序结果经SEQMAN软件拼接，获得全长cDNA序列；G、根据拼接好的全长cDNA序列在其5’UTR与3’UTR区设计引物，使用该基因特异引物分别对育性分离群体中可育株与不育株进行RT_PCR扩增，并对异源细胞质雄性不育系统的恢复系、保持系、不育系以及同源细胞质雄性不育系统的恢复系基因组DNA进行扩增，PCR扩增体系及程序为：TaqMIX 10µL，DNA模板1µL,正反向引物各1.5µL ,ddH2O 6µL，PCR扩增程序为95℃ 5min,94℃ 30 s,64℃ 45s,72℃ 3 min,共34个循环，然后75℃ 10min，PCR扩增产物用1.5%g/v琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后检测，在异源细胞质雄性不育恢复系中有分子量约2.1kb的扩增产物，在不育系、保持系及同源细胞质雄性不育恢复系中都无扩增产物，因此，根据全长cDNA序列5’UTR与3’UTR区设计的特异引物，其正向引物的序列为：TACGCGGGGAGAGAAGCTTGTCTCG，反向引物的序列为： CACATCATAACACACTAACCAGGACTTTGTCTC，扩增出的长度约为2.1kb 的DNA片段作为油菜野芥细胞质雄性不育恢复基因的分子标记，获得了一种油菜异源细胞质雄性不育恢复基因的分子标记。 |
