猪肝细胞与骨髓间充质干细胞共微囊化内置生物人工肝方法

摘要

本发明涉及一种猪肝细胞与骨髓间充质干细胞共微囊化内置生物人工肝方法。本发明先建立猪骨髓间充质干细胞体外培养扩增体系，再采用两步胶原酶法原位灌注分离猪原代肝细胞，然后藻酸盐-聚左旋赖氨酸制备微囊包被肝细胞和骨髓间充质干细胞。本发明克服了内置细胞通常无法长期存活，增殖能力极度有限，输注的肝细胞产生各种促肝再生刺激因子的功能也随之受到抑制等缺陷。本发明将骨髓间充质干细胞引入内置生物人工肝系统，通过异质细胞间相互作用，充分模拟肝细胞在体微环境，有效延长肝细胞的生存时间，促进肝细胞增殖分化，并保持肝细胞特有的生物学功能，从而显著改善内置生物人工肝治疗肝功能衰竭的治疗效果。

主权项

猪肝细胞与骨髓间充质干细胞共微囊化内置生物人工肝方法，其步骤在于：(1)建立猪骨髓间充质干细胞体外培养扩增体系：从成年健康实验用小型猪髂骨抽取骨髓，制备单细胞悬浮液，密度梯度离心后收集单核细胞层，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，随后放置于37℃、5％CO2培养箱中培养；(2)两步胶原酶法原位灌注分离猪原代肝细胞：将健康猪麻醉成功后外周静脉全身肝素化，结扎门静脉和肝下下腔静脉远心端，近侧插管分别作为灌注流入道和流出道，阻断肝上下腔静脉，使用D‑Hanks液灌注肝脏直到血色完全褪去，0.05％胶原酶缓慢持续原位灌注肝脏，收集肝细胞悬液，台盼蓝拒染试验计算细胞活力＞95％；(3)藻酸盐‑聚左旋赖氨酸制备微囊包被肝细胞和骨髓间充质干细胞：肝细胞与骨髓间充质干细胞混合成单细胞悬液，将上述单细胞悬液悬于2％海藻酸钠溶液，微囊静电液滴发生器滴入到100mmol/L的CaCl2中，形成海藻酸钙珠；0.05％多聚赖氨酸和0.14％海藻酸钠分别包裹海藻酸钙珠，以形成微胶囊；再用1mmol/L柠檬酸钠液化微胶囊核心。