一种用于高通量454测序的双末端文库的构建方法

摘要

本发明公开了一种用于高通量454测序的双末端文库的构建方法，包括步骤：将DNA片段化；末端补平；与环化接头连接；将DNA片段环化；将DNA片段化为300-800bp的大小；在DNA片段的3’端加上腺嘌呤；连接特异Y型接头；PCR扩增DNA片段；筛选大小为400-700bp的片段，即得所需的双末端文库。本发明采用Y型接头代替原有的A、B接头，增加了DNA片段的利用率，使文库构建的效率提高了4倍。通过在Y型接头中引入区分多样品的标签序列，实现了多样品平行测序，有效的利用了测序板的空间，每次实验的成本节约了30％；减少了实验步骤，降低了样品和试剂的损耗，提高了文库构建的成功率；减少了数据的冗余率，提高了数据的利用率。

主权项

一种用于高通量454测序的双末端文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将DNA片段化；(2)将片段化后的DNA末端补平；(3)将末端补平的DNA与带有生物素的环化接头连接，去除接头自连的片段；所述环化接头的序列为：5′‑ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT‑3′3′‑TATTGAAGCATATTACATACGATATGCTTCAATA‑5′(4)填补缺口，将DNA片段环化，切除未环化的DNA片段；(5)将DNA片段化为300‑800bp的大小；(6)补平300‑800bp的DNA片段末端，在DNA片段的3’端加上腺嘌呤；(7)通过链霉素抗生物素蛋白磁珠固定带有生物素的DNA片段，再连接Y型接头；所述Y型接头为：5′‑CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACGACT(N)nT‑3′3′‑GGATAGGGGACACACGGAACAGATAGGGGACAACGCACAGGCTGCTGA(N)np‑5′其中，(N))n为标签序列，n为6‑10的整数；(8)利用Y型接头的扩增引物，即5′‑CCATCTCATCCCTGCGTGTC‑3′，5′‑CCTATCCCCTGTGTGCCTTG‑3′PCR扩增步骤(7)的DNA片段；(9)筛选大小为400‑700bp的片段；即得所需的双末端文库。