固相多肽合成缩宫素的制备方法

摘要

本发明公开了一种固相多肽合成缩宫素(又名催产素)的制备方法，包括如下步骤：以Rink Amide树脂(包括Rink Amide MBHA树脂、RinkAmide AM树脂)为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以TBTU或HBTU/HOBt为缩合剂，依次逐个接上氨基酸；然后加入切肽试剂进行切肽，加入乙醚沉淀，获得还原型粗品，加入碱性物质，在pH为7.5-10.0的条件下通空气氧化或用双氧水进行氧化，获得氧化型粗品，最后采用C18或C8柱进行分离纯化，获得目标产物。本发明的方法，生产成本低，工艺简单，环境污染低，收率高，便于工业化实施。

主权项

一种固相多肽合成缩宫素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以Rink Amide树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以TBTU/HOBt为缩合剂，依次逐个接上氨基酸；然后加入切肽试剂进行切肽，切肽试剂为TFA/TIS/EDT/H2O＝900ml/40ml/25ml/10ml，切肽试剂用量为5～20ml/g，于15～35℃反应1.5～5小时，过滤，滤液加入乙醚沉淀，获得还原型粗品；加入碱性物质，在pH为7.5‑10.0的条件下用双氧水进行氧化，获得氧化型粗品；最后采用C18柱进行分离纯化，流动相为0.1MNH4Ac或磷酸缓冲液∶乙腈＝9∶1，指体积比；流速为：100‑650ml/min；检测波长为：280nm；用HPLC跟踪收集所需要的流出液，然后采用常规的方法冻干，获得目标产物，以Rink Amide树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以TBTU/HOBt为缩合剂，依次逐个接上氨基酸的方法包括如下步骤：(1)树脂的预处理：将Rink Amide树脂用DMF浸泡10～60分钟，使树脂充分溶胀，氮气吹干，加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～60分钟，氮气吹去六氢吡啶，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为15～25％；六氢吡啶的DMF溶液中，Rink Amide树脂的重量浓度为5～15ml/g；(2)Fmoc‑Gly‑树脂的制备：将步骤(1)的预处理的树脂加入Fmoc‑Gly‑OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc‑Gly‑树脂；NMM和DMF中，步骤(1)的预处理的树脂的重量体积浓度为5～15 ml/g，Fmoc‑Gly‑OH的摩尔数为树脂的2～6倍；六氢吡啶的DMF溶液中，步骤(1)的预处理的树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；(3)Fmoc‑Leu‑Gly‑树脂的制备：将步骤(2)的Fmoc‑Gly‑树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，脱帽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；加入Fmoc‑Leu‑OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc‑Leu‑Gly‑树脂；NMM和DMF中，Fmoc‑Leu‑OH的重量体积浓度为5～15ml/g；六氢吡啶的DMF溶液中，步骤(2)的Fmoc‑Gly‑树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；(4)Fmoc‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂的制备：将步骤(3)的Fmoc‑Leu‑Gly‑树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，脱帽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；加入Fmoc‑Pro‑OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂；NMM和DMF中，步骤(3)的Fmoc‑Leu‑Gly‑树脂的重量体积浓度为5～15ml/g，Fmoc‑Pro‑OH的摩尔数为树脂的2～6倍；六氢吡啶的DMF溶液中，Fmoc‑Leu‑Gly‑树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；(5)Fmoc‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂的制备：将步骤(4)的Fmoc‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，脱帽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干。 加入Fmoc‑Cys(Trt)‑OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂；NMM和DMF中，步骤(4)的Fmoc‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂的重量体积浓度为5～15ml/g，Fmoc‑Cys(Trt)‑OH的摩尔数为树脂的2～6倍；六氢吡啶的DMF溶液中，Fmoc‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；(6)Fmoc‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂的制备：将步骤(5)的Fmoc‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，脱帽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；加入Fmoc‑Asn(Trt)‑OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；然后获得Fmoc‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂；NMM和DMF中，步骤(5)的树脂的重量体积浓度为5～15ml/g，Fmoc‑Asn(Trt)‑OH的摩尔数为树脂的2～6倍；六氢吡啶的DMF溶液中，Fmoc‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；(7)Fmoc‑Gln(Trt)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂的制备：将步骤(6)的Fmoc‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，脱帽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；加入Fmoc‑Gln(Trt)‑OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc‑Gln(Trt)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂；NMM和DMF中，步骤(6)的树脂的重量体积浓度为5～15ml/g， Fmoc‑Gln(Trt)‑OH的摩尔数为树脂的2～6倍；六氢吡啶的DMF溶液中Fmoc‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；(8)Fmoc‑Ile‑Gln(Trt)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂的制备：将步骤(7)的Fmoc‑Gln(Trt)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，脱帽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；加入Fmoc‑Ile‑OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc‑Ile‑Gln(Trt)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂；NMM和DMF中，步骤(7)的树脂的重量体积浓度为5～15ml/g，Fmoc‑Ile‑OH的摩尔数为树脂的2～6倍；六氢吡啶的DMF溶液中Fmoc‑Gln(Trt)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；(9)Fmoc‑Tyr(tBu)‑Ile‑Gln(Trt)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂的制备：将步骤(8)的Fmoc‑Ile‑Gln(Trt)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，脱帽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干。加入Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF。接肽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc‑Tyr(tBu)‑Ile‑Gln(Trt)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂；NMM和DMF中，步骤(8)的树脂的重量体积浓度为5～15ml/g，Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH的摩尔数为树脂的2～6倍；六氢吡啶的DMF溶液中 Fmoc‑Ile‑Gln(Trt)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂的重量体积浓度为5～15ml/g：(10)Fmoc‑Cys(Trt)‑Tyr(tBu)‑Ile‑Gln(Trt)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂的制备：将步骤(9)的Fmoc‑Tyr(tBu)‑Ile‑Gln(Trt)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，脱帽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；加入Fmoc‑Cys(Trt)‑OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc‑Cys(Trt)‑Tyr(tBu)‑Ile‑Gln(Trt)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂；NMM和DMF中，步骤(9)的树脂重量体积浓度为5～15ml/g，Fmoc‑Cys(Trt)‑OH的摩尔数为树脂的2～6倍；六氢吡啶的DMF溶液中Fmoc‑Tyr(tBu)‑Ile‑Gln(Trt)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Leu‑Gly‑树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；