小鼠脂联素基因超表达载体的构建及用途

摘要

本发明提供一种小鼠脂联素基因超表达载体的构建方法，通过将RT-PCR技术克隆得到的小鼠脂联素片段并连接到pTarget哺乳动物表达载体系统上，转化大肠杆菌DH5α，构建得到pTarget/ADP超表达载体的重组质粒，构建好的pTarget/ADP超表达载体对ADP具有很好的增强基因表达量的效果。本发明开拓了目前研究动物脂肪代谢调控和基因功能研究的思路。所用的超表达载体方便易得，载体构建方法简单、可行，能够特异、高效地增强ADP基因的表达，可在制备治疗肥胖及代谢性综合症药物中的应用。或在建立动物模型进行ADP对糖和脂肪代谢的调节及肌纤维生长，发育的影响研究中的应用。

主权项

一种小鼠脂联素基因超表达载体的构建方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)提取正常ICR雄性小鼠白色脂肪组织中的RNA，反转录为CDNA，得到小鼠ADP DNA片段，序列如SEQ ID NO:1所示；(2)RT‑PCR 扩增：以（1）得到的CDNA为模板,上下游引物为：SEQ ID NO:2  5'‑ATGCTACTGTTGCAAGCTCT‑3' SEQ ID NO:3  5'‑TCAGTTGGTATCATGGTAGA‑3'用pfu DNA聚合酶进行PCR反应，扩增条件为93℃、3分钟预变性后，94℃50 秒、56℃45秒‑2分钟、72℃30秒共30个循环，最后1轮循环完成后再72℃延伸10 分钟，反应完毕后，用1％琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果； (3)表达载体构建：将回收的目的DNA片段连至pTarget载体．转化大肠杆菌‑TOP10感受态细胞中，涂布含100mg/mL氨苄西林的LB平板上，过夜培养，挑取单菌落至含有同样浓度Amp的液体培养液中．抽提质粒，用EcoRI酶切质粒，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。