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一种羊水源性神经干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将无菌的胎儿羊水用细胞筛网过滤，分别收集滤液和沉淀，将滤液离心后收集上清，获得羊水上清液，将羊水上清液与羊水细胞培养液按照1∶0.5～2的体积比混合后，得到混合培养液；用混合培养液将沉淀物重悬，制成细胞悬浮液，并接种于贴壁细胞培养瓶中，在37℃、5％CO2培养箱中培养，每隔4天换液；当培养瓶铺满单层细胞时，吸弃培养液，加入细胞分离无酶缓冲液，待全部细胞脱壁后，分散细胞，收集细胞悬液后离心去除上清，收集细胞得到羊水细胞；所述的羊水细胞培养液是以MEMα‑medium为基础培养基，还包括以下组分：体积分数10～20％的胎牛血清、质量分数1～2％的L‑谷氨酰胺、100～200IU/mL青霉素、100～200μg/mL链霉素和质量分数2～5％的Chang Medium；2)用羊水源性神经干细胞培养液稀释羊水细胞制成细胞悬浮液，将细胞悬浮液接种于培养板，在37℃、5％CO2培养箱中培养；待羊水细胞中的神经干细胞生长形成神经球悬浮于培养液时，吸取神经球转移至培养板中，加入神经球消化液消化成絮状物，再将絮状物转移至羊水源性神经干细胞培养液中，用吸管吹吸絮状物，使其分散为单个细胞形成细胞悬液，然后接种于包含有羊水源性神经干细胞培养液的培养板中，在37℃、5％CO2和饱和湿度下培养，每2d在培养液中添加终浓度为0.1～1ng/L的EGF和终浓度为0.01～0.1ng/L的bFGF；5d以后吸取形成的神经球，将神经球用神经球消化液消化分离后，得到羊水源性神经干细胞；所述的50mL羊水源性神经干细胞培养液包含1～2mL B27培养液、0.5～2mL N2培养液、5～10×10‑3ng的表皮生长因子、5～10×10‑4ng的碱性成纤维细胞生长因子、50～100IU的青霉素、50～100μg的链霉素和50～100μg的L‑谷氨酰胺，其余为Neurobasal medium；所述的20mL消化液包含1.5～3mmol Na2SO4、0.6～1mmol K2SO4、0.1～0.5mmol MgCl2、0.005～0.01mmol CaCl2、0.02～0.05mmol N‑(2‑羟乙基)哌嗪‑N′‑2‑乙磺酸，0.4～1.0mmol葡萄糖、0.0025～0.005mmol NaOH、6.0～8.0mg半胱氨酸和200～300μg木瓜蛋白酶，其余为水。 |
