一种无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的构建方法

摘要

一种无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的构建方法，属于生物工程技术领域。本发明为一种选育大片段缺失的无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的系统方法，主要包括融合PCR方法得到大片段缺失的同源重组片段，高效率酵母电转化感受态的制备，制霉菌素富集和限制性培养基筛选。通过一整套系统方法，可以在3-5天内快速的得到目的营养缺陷型菌株。大片段的缺失，有效的避免了回复突变和与外源质粒的同源重组。此外，由于在整个过程中未使用任何抗性标记，使用该方法还可以在同一出发菌株上使用多次，得到多重营养缺陷型，供后续基因工程研究使用。

主权项

一种无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的构建方法，其特征是有机的结合了融合PCR技术，酵母高效率感受态制备及转化技术，制霉菌素富集技术及限制性培养基筛选技术，构建了3种光滑球拟酵母缺陷型菌株：分别是精氨酸缺陷型光滑球拟酵母菌株，尿嘧啶缺陷型光滑球拟酵母菌株，精氨酸和尿嘧啶双缺陷型光滑球拟酵母菌株；(1)融合PCR技术：根据融合PCR技术，使用4条引物：P1 ARG8‑leftS：GAACAATACCACCGTAAGTGAG，P2 ARG8‑leftA：TAATTTTGGTTAACGCTTAGGGAAAACAGAT，P3 ARG8‑rightS：TAAGCGTTAACCAAAATTACAGTACCCAAGC，P4 ARG8‑rightA：CGATAATAACATAGATGCCGACA，使用pfu高保真DNA聚合酶从基因组上PCR得到Δarg8基因的左右两臂，再进一步进行融合PCR将左右臂连接起来；或根据融合PCR技术，使用另4条引物：P5 URA3‑leftS：TACTGCGGCCGCTAAAGTTGACTCTCGCTAC，P6 URA3‑leftA：ACTTACAGAATTCAAGACATATCCAATAG，P7 URA3‑rightS：GTCTTGAATTCTGTAAGTGTACTCTTGATGG，P8 URA3‑rightA：TCGCGGATCCAACAATTCAACATTATACTTA，使用pfu高保真DNA聚合酶从基因组上PCR得到URA3基因的左右两臂，再进一步进行融合PCR将左右臂连接起来；(2)酵母高效率感受态制备及转化技术：a)挑单菌落接种于5mL YPD培养基中，30℃过夜培养至饱和；b)0.1％接种至100mLYPD培养基中，30℃培养10h，细胞密度为1×108细胞/mL；c)培养物分装至两个50mL预冷的无菌离心管中，5000rpm、5min离心去上清，每管加入8mL无菌水重悬，合并成一管；d)加入2mL pH 7.5的10倍TE缓冲液，摇动混匀，加入2mL 1mol·L‑1醋酸锂和0.5mL 1mol·L‑1二硫代苏糖醇，旋转混匀，30℃，50rpm，摇45min；e)菌悬液稀释至50mL水中，5000rpm、5min沉淀细胞，去上清，重复一次；f)用适量预冷的1mol·L‑1山梨醇重悬，使最终菌悬液OD＝200；按每份80μL分装于1.5mL离心管中，直接转化或保存于‑80℃；g)将20μL的PCR片段，与80μL的上述步骤f)所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，冰浴5min；h)采用电穿孔仪进行电转化：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω；电击时间为5ms；i)电击完毕后，加入1mL冰预冷的1mol·L‑1山梨醇溶液将菌体混匀，转移至1.5mL的离心管中；(3)制霉菌素富集技术及限制性培养基筛选技术：j)将步骤i)所得菌悬液转入YPD液体培养基中24h后，离心；k)所得菌体用NFMM洗涤后继续在NFMM中培养6h，用NFMM离心洗涤后，再加入MM培养2h；l)MM离心洗涤后，分别加入制霉菌素和蔗糖至终浓度10μg·L‑1和170g·L‑1，培养30‑120min；r)将菌体悬液稀释10，100，1000倍分别涂布于LM平板上；s)将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现；t)小菌落为可能的营养缺陷型菌株；u)挑取平板上的小菌落进一步在MM平板相应的SM平板上进行划线分离确认；v)营养缺陷型菌株进一步用菌落PCR进行验证；所述YPD培养基：酵母抽提物10g·L‑1，胰蛋白胨2.0g·L‑1，葡萄糖20g·L‑1；无氮源基本培养基NFMM：葡萄糖20g·L‑1，KH2PO41.0g·L‑1，MgSO4·7H2O0.5g·L‑1；基本培养基MM：NFMM中加入(NH4)2SO410g·L‑1；限制性培养基LM：MM中加入0.5％的YPD；各种补充培养基SM‑ARG：MM中加入相应的营养物质80mg·L‑1精氨酸，SM‑URA：MM中加入相应的营养物质80mg·L‑1尿嘧啶，SM‑ARG/URA：MM中加入相应的营养物质80mg·L‑1精氨酸和80mg·L‑1尿嘧啶；维生素溶液：烟酸1.0g·L‑1，生物素5.0mg·L‑1，维生素B15.0mg·L‑1，维生素B650mg·L‑1；以上所有培养基中每升均加入10mL维生素溶液和1mL 100g·L‑1氨苄青霉素，pH均调节至6，并在115℃灭菌10min.相应的YPD，MM和SM平板均加入20g·L‑1琼脂粉；而LM平板仅加入15g·L‑1琼脂粉。