从人血浆组分FIV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶的方法

摘要

本发明公开了一种人血浆组分FIV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于包括以下步骤：(A)血浆沉淀预处理；(B)阴离子凝胶层析；(C)凝胶过滤层析；(D)超滤脱盐浓缩；(E)巴氏病毒灭活；(F)冻干分装；(G)干热消毒。本发明是以人血白蛋白生产过程中产生的弃料FIV组分沉淀为原料，采用层析技术分离纯化一种蛋白酶抑制剂即α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，α1-AT)，建立α1-AT浓缩制剂的生产工艺。本方法制备的产品纯度好、收率高，操作简单易行，同时占用设备少、劳动强度小、能耗低，以白蛋白生产的废弃物料作原料，生产成本低。

主权项

一种从人血浆组分FIV沉淀中分离纯化α1‑抗胰蛋白酶的方法，其特征在于包括以下步骤：(A)血浆沉淀预处理：取FIV沉淀加溶解液稀释到蛋白含量2％～5％，pH8.0～8.5，离子强度0.09‑0.12，温度控制在2～8℃搅拌过夜，按照0.5％～15％的比例(W/V)加入硅酸盐助剂在2‑8℃搅拌1h，固液分离，取上清液，按照0.5％‑15％的比例(W/V)再次加入硅酸盐助剂在2‑8℃搅拌3h，固液分离，取上清液进样层析柱，其中溶解液为8～18mM的磷酸盐缓冲液或30～35mM的醋酸盐缓冲液；溶解液中添加的助剂为硅藻土或珍珠岩，添加量为每100毫升溶解液添加0.5克‑15克；(B)阴离子凝胶层析：取凝胶，室温放置达到温度平衡后装柱，以缓冲液洗脱平衡，pH6.0～6.5，平衡量为柱体积的8～12倍，将上清液上样于平衡好的层析柱，用缓冲液洗脱，pH6.0～6.5，温度控制在2～8℃，洗柱8～10倍柱体积，于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性地收集以含有a 1‑AT即a 1‑抗胰蛋白酶为主要成分的组分，其中离子交换层析填料为DEAF‑SepharoseFast Flow凝胶，洗脱液为8～18mM的磷酸盐缓冲液或30～35mM的醋酸盐缓冲液或12～25mM的柠檬酸盐缓冲液，流速控制在2.0～4.5L/h；(C)凝胶过滤层析：取凝胶，室温放置达到温度平衡后装柱，以缓冲液平衡，将层析后收集的a1‑AT的组分调至pH 7.0‑7.5，上样于平衡好的SephacrylS‑200柱，用相同的缓冲液洗脱，同时于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性地收集a 1‑AT的组分，其中凝胶过滤层析填料为SephacrylS‑200凝胶，洗脱液为8～18mM的磷酸盐缓冲液或30～35mM的醋酸盐缓冲液或12～25mM的柠檬酸盐缓冲液，pH7.0‑7.5，洗脱量为柱体积的8‑12倍，流速控制在每小时1.5～3.5倍柱体积，洗脱温度控制在2‑8℃；(D)超滤脱盐浓缩；(E)巴氏病毒灭活：将浓缩蛋白液加无热原注射用水稀释，加入保护剂，于60±0.5℃保温8～12小时，灭活血浆蛋白制品中的病毒，其中巴氏消毒的保护剂为甘氨酸和麦芽糖混合保护剂，甘氨酸含量控制在45‑55mM，麦芽糖含量控制在25％‑35％；(F)冻干分装：巴氏灭活的a 1‑AT蛋白液经除菌过滤，转入冻干机真空冻干；(G)干热消毒：分装的冻干粉针放置于保温库中保温，灭活病毒，转入成品库全检包装，其中冻干制品的保温温度为80℃，保温时间为60～72小时。