饲喂dsRNA抑制昆虫基因表达的方法

摘要

本发明提供一种饲喂dsRNA抑制昆虫基因表达的方法，涉及通过自然饲喂沉默特定基因的dsRNA调控昆虫的生长发育领域。它选择了几丁质合成酶基因SeCHS-A上的基因片段SeA3，通过自然饲喂后研究对昆虫的影响。主要包括：选择合适的表达载体L4440与目的基因片段SeA3构建重组表达载体L4440-SeA3；然后把该重组载体在特定的受体细胞大肠杆菌HT115(DE3)中、在体外适应条件下诱导表达；再把已经表达出dsRNA的受体菌htLSA3加入昆虫的饲料中，用该饲料对昆虫幼虫进行自然饲喂，检测饲喂后昆虫抑制该基因表达情况并记录昆虫的表现型的改变。采用自然取食抑制昆虫基因的表达，探索害虫控制的新途径。

主权项

一种饲喂dsRNA抑制甜菜夜蛾Spodoptera exigua或斜纹夜蛾Spodoptera litura基因表达的方法，通过dsRNA触发的基因沉默来抑制特定基因mRNA在甜菜夜蛾或斜纹夜蛾的发育过程中的表达，其特征在于：主要包括以下步骤：①选定特定功能的dsRNA片段：该特定功能的基因为昆虫几丁质合成酶基因SeCHS‑A，选定特定功能的dsRNA片段为SeCHS‑A基因上一段特异性的基因片段SeA3，该基因片段SeA3的基因序列为如附录SEQ ID NO1所示；②提取甜菜夜蛾五龄幼虫的总RNA，通过RT‑PCR得到cDNA；③通过PCR技术扩增出目的基因片段SeA3：根据选用昆虫几丁质合成酶基因SeCHS‑A，设计一对基因特异引物——SeCHSA3_F和SeCHSA3_R，以上一步得到的cDNA作为模板，通过PCR技术扩增出目的基因片段SeA3片段，其中，正向引物SeCHSA3_F的基因序列为5′‑TCGCCATGGTTGTATTCTTCTTCGCCTTG‑3′，反向引物SeCHSA3_R的基因序列为5′‑GACAAGCTTGTCGCCTATGGTGGTTTCGT‑3′；④构建含有选定的dsRNA片段的重组表达载体：选用载体L4440为构建重组表达载体的空载体，将此基因片段SeA3用T4DNA连接酶插入载体L4440中，构建重组表达载体L4440‑SeA3，转化入宿主菌——大肠杆菌DH5α中；⑤重组表达载体向受体菌的转化：从上一步骤的大肠杆菌DH5α中回收纯化重组表达载体L4440‑SeA3，再将该重组表达载体L4440‑SeA3转化入dsRNA表达受体菌——大肠杆菌HT115(DE3)中；⑥通过基因诱导使受体菌表达SeA3的dsRNA片段：在一定的温度、转速和时间下诱导转化入受体菌HT115(DE3)中的重组表达载体L4440‑SeA3表达相应昆虫基因片段的dsRNA片段； ⑦对表达了dsRNA片段的受体菌进行纯化、富集：将前一步获得的已经表达了dsRNA片段的受体菌即大肠杆菌HT115(DE3)进行纯化、富集；⑧将富集的表达了dsRNA片段的受体菌加入饲料并喂养甜菜夜蛾或斜纹夜蛾幼虫：将富集表达了dsRNA片段的大肠杆菌HT115(DE3)用适当的无菌水稀释，按照一定的比例均匀加入甜菜夜蛾或斜纹夜蛾人工饲料中，饲喂适当龄期的甜菜夜蛾或斜纹夜蛾幼虫，饲料每天更换；⑨采用RT‑PCR检测甜菜夜蛾或斜纹夜蛾幼虫的SeCHS‑A基因的表达：饲喂特定的时间后，取甜菜夜蛾或斜纹夜蛾幼虫做RT‑PCR检测，检测其SeCHS‑A基因的表达情况；并持续饲养为取材检测的幼虫，记录幼虫经RNAi后的表现型；⑩检测甜菜夜蛾或斜纹夜蛾幼虫的SeCHS‑A基因的表达情况。