筛选和鉴定乙肝病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞表位方法

摘要

本发明公开了一种筛选和鉴定乙肝病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞表位方法，包括以下步骤：1）制备可负载任意多肽的人工抗原提呈细胞aAPC；2）表位肽负载aAPC；3）负载抗原肽的aAPC体外诱导HBV抗原特异性CTL；4）以表达HBV抗原的细胞作为靶细胞研究上述步骤3）所得的HBV抗原特异性CTL抗HBV的功能：以表达HBV抗原的细胞作为靶细胞，该靶细胞是HepG2.2.15细胞；分别进行CTL杀伤实验、测定HBV表面抗原及测定HBV相关基因DNA。采用该方法可以用于大规模的CTL表位的筛选和鉴定。

主权项

筛选和鉴定乙肝病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞表位方法，其特征是包括以下步骤：1)、制备可负载任意多肽的人工抗原提呈细胞aAPC：采用MHC I‑Ig和抗CD28mAb包被磁珠：用直接包被法将MHC I‑Ig和抗CD28mAb包被在磁珠上，构建成可负载任意多肽的人工抗原提呈细胞aAPC；2)、表位肽负载aAPC：MHC I‑Ig和抗CD28mAb包被的aAPC经PBS洗涤，以PBS将表位肽分别配制成浓度为20～40μg/ml多肽溶液，再将洗涤后的aAPC以4～8×108/ml浓度重悬到所述多肽溶液中，得负载抗原肽的aAPC；负载的表位肽的序列是：Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val；3)、负载抗原肽的aAPC体外诱导HBV抗原特异性CTL：分离HLA‑A*0201正常人外周血PBMC细胞，以MACS技术分选获得CD8+T细胞；将CD8+T细胞与负载抗原肽的aAPC在培养基中37℃、5％CO2培养刺激3～4周，所述培养基为OpTmizerTM T‑Cell Expansion SFM serum free；再以磁铁吸附分离抗原特异性CTL；以负载无关肽的aAPC为阴性对照；对所获得的抗原特异性CTL采用Tetramer染色法测定其数量；4)、以表达HBV抗原的细胞作为靶细胞研究上述步骤3)所得的HBV抗原特异性CTL抗HBV的功能：以表达HBV抗原的细胞作为靶细胞，该靶细胞是HepG2.2.15细胞；分别进行CTL杀伤实验、测定HBV表面抗原及其测定HBV相关基因DNA。