一种删除转基因杨树选择标记基因的方法

摘要

本发明公开了一种删除转基因杨树选择标记基因的方法，该方法首先将转基因杨树试管苗置于培养基M上以根部萌蘖芽方式继代繁殖，剪取叶盘培养，然后浸入带有pX6-GFP质粒的农杆菌EHA105菌液浸泡10~15min，去除菌液后培养至完整植株，剪取完整植株茎段，在含有β-雌二醇的培养基中培养至植株再生。本发明的方法利用培养基中添加的β-雌二醇，通过诱导转基因植株茎段形成愈伤至植株再生过程删除选择标记基因，利用Cre/lox系统具有的重组删除功能，建立无选择标记基因的杨树转基因体系，为培育具生物安全的转基因杨树新品种提供一个新途径，为安全、高效的林木转基因育种提供基础。

主权项

一种删除转基因杨树选择标记基因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）采用感受态热激法将pX6‑GFP质粒转入农杆菌EHA105，菌液涂抹在含有抗生素的YEB平板上，28℃培养24~36h，得转化后的单菌落，备用；（2）将转基因杨树试管苗置于培养基M上以根部萌蘖芽方式继代繁殖1个月，备用；其中，培养基M的配方为在基本培养基MS中添加：蔗糖25~30g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8；（3）在步骤（2）培养的试管苗上选取幼嫩、平展的叶，剪去叶边缘，得叶盘为外植体，接种于叶盘分化培养基T上，控温25±2℃，光照3000~4000lux，光照时间16~18h/d，培养2~3d；（4）在农杆菌液体培养基中扩大培养步骤（1）的单菌落，得指数生长期的菌体，在基本培养基MS液体培养基悬浮菌体，得OD600值为0.3~0.4的侵染菌液；（5）将步骤（3）的培养后的外植体浸入步骤（4）的侵染菌液，振荡，浸泡10~15min，除去多余菌液，转至含有50~100μmol/L乙酰丁香酮的叶盘分化培养基T上暗培养2~3d，期间多次洗除菌液；（6）先将步骤（5）暗培养后的叶盘转移到叶盘分化筛选培养基W上培养，直至分化出不定芽；再将不定芽连同外植体一同移入不定芽伸长筛选培养基Y继代培养；待不定芽伸长至1.5~2cm长，将每个不定芽分离独立移入生根筛选培养基G，直至形成完整植体；（7）剪取步骤（6）中完整植株的茎段，依次在删除选择标记分化培养基W’、删除选择标记不定芽伸长培养基Y’、删除选择标记生根培养基G’中培养诱导愈伤组织至植株再生；利用培养基中添加的β‑雌二醇，通过诱导步骤（8）获得的转基因植株茎段形成愈伤至植株再生过程删除选择标记基因；（8）对步骤（7）的转基因植株进行PCR分子检测和卡那霉素敏感性试验检测。