通过敲除<i>abrB</i>基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法

摘要

本发明涉及通过敲除abrB基因提高枯草杆菌抗菌肽产量的方法，属于生物技术领域。本方法首先以枯草芽孢杆菌ATCC9943为出发菌株，以大肠杆菌克隆载体pGEM-T为骨架构建一个基因敲除载体pAbrB-Cm，利用同源重组原理，通过双交换过程敲除枯草芽孢杆菌ATCC9943基因组abrB基因的方法构建了一个高产抗菌肽菌株FMB29。经过高效液相色谱分析，确定改良菌株产surfactin和fengycin的能力大大提高，并通过质谱鉴定了改良菌体FMB29发酵产物中surfactin和fengycin的存在。

主权项

通过敲除abrB基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，其特征在于：（1）abrB基因敲除载体pAbrB‑Cm的构建设计引物AbrB5’‑F和AbrB5’‑R，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增部分5’端abrB基因及其上游基因，获得500bp基因片段；设计引物AbrB3’‑F和AbrB3’‑R，以枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增部分3’端abrB基因及其下游基因，获得500bp基因片段；设计引物CM‑F和CM‑R，以pHCMC04质粒为模板PCR扩增包括启动子和终止子的氯霉素抗性基因表达框，获得1500bp基因片段；扩增得到的三个基因分别克隆至pMD19‑T载体，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a，经验证、测序正确后，分别命名为pabrB5’‑T、pabrB3’ ‑T、pCM‑T，于‑20℃条件下保存备用；pabrB5’‑T用EcoRI/XbaI双酶切后获得abrB5’片段，与经过相同双酶切处理的pGEM‑T载体，用T4 DNA连接酶连接，构建pGEM‑abrB5’载体，酶切验证正确后于‑20℃条件下保存备用；pabrB3’‑T用XbaI/SphI双酶切后获得abrB3’片段，与经过相同双酶切处理的pGEM‑ abrB5’载体，用T4 DNA连接酶连接，构建pGEM‑abrB载体，酶切验证正确后于‑20℃条件下保存备用；pCM‑T用XbaI酶切后获得CM片段，与经过相同酶切处理的pGEM‑abrB载体，用T4 DNA连接酶连接，构建abrB基因敲除载体pAbrB‑Cm，酶切验证正确后，转化大肠杆菌DH5a，用于下一步转化；（2）FMB 29突变菌株的构建以枯草芽孢杆菌ATCC 9943制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的abrB基因敲除载体pAbrB‑Cm转化入枯草芽孢杆菌ATCC 9943，在基因组abrB位点发生双交换，CM抗性平板上筛选得到氯霉素抗性菌株，命名为FMB 29；该菌株的abrB基因被氯霉素抗性基因所取代，成为缺失了abrB基因的突变菌株，即为所得到的菌株。