一种β-内酰胺类药物通用人工抗原的合成方法

摘要

一种β-内酰胺类药物通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以6-氨基青霉烷酸为半抗原，用N-(m-马来酰亚胺基苯甲酰氧基)琥珀酰亚胺MBS法将其与载体蛋白牛血清蛋白BSA偶联，用凝胶电泳法测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了6-APA人工通用抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原，可以满足国内对其研究的需要。

主权项

一种β‑内酰胺类药物通用人工抗原的合成方法，其特征是以6‑氨基青霉烷酸6‑APA为半抗原，用N‑(m‑马来酰亚胺基苯甲酰氧基)琥珀酰亚胺MBS法将其与载体蛋白牛血清蛋白BSA偶联，合成青霉素类抗生素中间体6‑氨基青霉烷酸人工抗原6‑APA‑BSA，用凝胶电泳法测定偶联物的偶联比；工艺步骤为：(1)6‑氨基青霉烷酸的酰化取70μmol 6‑APA溶于3mL pH7.0、0.05mol/L磷酸盐缓冲液中，加入到含有70μmol 22mg MBS、2mL四氢呋喃的25mL烧杯中，混合液在37℃下反应3小时，冷冻干燥，得到白色固体，用乙醚和二氯甲烷V/V＝2∶1混合溶液洗涤五次，洗去未反应的MBS；MBS的监测：硅胶薄层板的制作，称取硅胶12g，溶解在40mL 0.5％质量浓度的羟甲基纤维素钠溶液中，用玻璃棒充分搅拌成糊状，超声波振荡1分钟，均匀涂布在玻璃板上，置于阴凉处自然干燥后，放入105℃的烘箱中活化1h，最后放入干燥箱中备用；薄层层析法检测：硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为乙醚和二氯甲烷V/V＝2∶1混合溶液，展开至薄板3/4处，取板，吹干溶剂；将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.95处观察不到显色点作为洗涤终点；(2)牛血清蛋白的巯基化称2‑亚氨基硫烷13.6mg溶于1mL的pH 8.0，含有0.01mol/L乙二胺四乙酸EDTA的0.05mol/L PBS中，加入到5mL含有67mg牛血清蛋白的pH 8.0、含有0.01mol/L EDTA的0.05mol/L PBS溶液中，在室温下反应1小时；(3)6‑氨基青霉烷酸与牛血清蛋白的偶联制备A液：巯基化的蛋白质溶液用0.2mol/L NaH2PO4调pH至7.2，低温保存；制备B液：酰化后6‑氨基青霉烷酸溶于2mL的pH7.2、0.05mol/L PBS中，低温保存；A液加入到B液中室温反应2小时，即得人工抗原混合液；透析袋前处理：取15cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的PBS溶液透析3天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到6‑氨基青霉烷酸人工抗原6‑APA‑BSA；(4)人工抗原的鉴定：人工抗原采用凝胶电泳法鉴定其偶联结果，利用标准蛋白所得标准曲线，计算其偶联比。