ATL肽的固相合成方法

摘要

本发明公开了一种ATL肽的固相合成方法。采用MBHA树脂作为固相载体，首先在该树脂上连接保护赖氨酰基Boc-Lys(2-CI-Z)，采用Boc保护氨基酸的程序接肽法完成ATL的合成，用乙酸酐对N端进行乙酰化修饰，得到全保护的肽树脂；用哌啶脱除Trp的甲酰基(For)侧链保护基，最后用三氟甲磺酸脱除侧链保护基团，并切割树脂，得到ATL粗肽制品；然后用反相C18填料的高效液相纯化该粗制品，甲醇-水梯度洗脱方法分离纯化，得ATL肽精制产品。本发明的方法条件具有单步缩合反应产率高，副产物少，最终粗品纯度高，杂质含量少，操作简单易行，总收率高的特点。

主权项

一种ATL肽的固相合成方法，包括下列步骤：1)以MBHA树脂为固相载体和起始原料，在MBHA树脂上依次进行缩合反应连接保护氨基酸，制备H2N‑Arg(Mts)‑Tyr(2‑Br‑Z)‑Tyr(2‑Br‑Z)‑Arg(Mts)‑Trp(For)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA树脂(1)向MBHA树脂中加入5％三乙胺DCM溶液洗2～3次；再用二氯甲烷、乙醇交替洗树脂2～3次，抽干；(2)向上述树脂中加入1～5当量Boc‑保护氨基酸，1～5当量的HOBt，而后加入1～5当量的N，N‑二环己基碳二亚胺，室温下搅拌1～6小时，抽干；其中，所述HOBt或N，N‑环己基碳二亚胺用二氯甲烷与N，N‑二甲基甲酰胺的混合液溶解，且混合液中二氯甲烷∶N，N‑二甲基甲酰胺的体积比为1∶0.8、1∶0.9或1∶1；(3)将(2)中反应后的树脂用二氯甲烷、乙醇交替洗3次，抽干；(4)树脂用50％三氟醋酸/二氯甲烷洗1～2次；(5)树脂用二氯甲烷洗2～3次；得树脂H2N‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA；再以H2N‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得H2N‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA；再以H2N‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得H2N‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA；再以H2N‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得H2N‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA；再以H2N‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得H2N‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA；再以H2N‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得H2N‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA；再以H2N‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得H2N‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA；再以H2N‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得H2N‑Trp(For)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA；再以H2N‑Trp(For)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得 H2N‑Arg(Mts)‑Trp(For)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA；再以H2N‑Arg(Mts)‑Trp(For)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得H2N‑Tyr(2‑Br‑Z)‑Arg(Mts)‑Trp(For)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA；再以H2N‑Tyr(2‑Br‑Z)‑Arg(Mts)‑Trp(For)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得H2N‑Tyr(2‑Br‑Z)‑Tyr(2‑Br‑Z)‑Arg(Mts)‑Trp(For)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA；再以H2N‑Tyr(2‑Br‑Z)‑Tyr(2‑Br‑Z)‑Arg(Mts)‑Trp(For)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得H2N‑Arg(Mts)‑Tyr(2‑Br‑Z)‑Tyr(2‑Br‑Z)‑Arg(Mts)‑Trp(For)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA树脂；其中：步骤(2)所述Boc‑保护氨基酸在MBHA树脂上依次进行缩合反应连接的氨基酸是：Boc‑Lys(2‑Cl‑Z)‑OH，Boc‑Lys(2‑Cl‑Z)‑OH，Boc‑Lys(2‑Cl‑Z)‑OH，Boc‑Lys(2‑Cl‑Z)‑OH，Boc‑Lys(2‑Cl‑Z)‑OH，Boc‑Lys(2‑Cl‑Z)‑OH，Boc‑Lys(2‑Cl‑Z)‑OH，Boc‑Trp(For)‑OH，Boc‑Arg(Mts)‑OH，Boc‑Tyr(2‑Br‑Z)‑OH，Boc‑Tyr(2‑Br‑Z)‑OH，Boc‑Arg(Mts)‑OH；2)用乙酸酐对N端进行乙酰化修饰将50±2当量的乙酸酐DMF溶液加入H2N‑Arg(Mts)‑Tyr(2‑Br‑Z)‑Tyr(2‑Br‑Z)‑Arg(Mts)‑Trp(For)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA树脂中，室温搅拌5～6小时，抽干；树脂用二氯甲烷、乙醇交替洗2～3次，抽干，得Ac‑Arg(Mts)‑Tyr(2‑Br‑Z)‑Tyr(2‑Br‑Z)‑Arg(Mts)‑Trp(For)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA；3)用哌啶脱除Trp的甲酰基侧链保护基向Ac‑Arg(Mts)‑Tyr(2‑Br‑Z)‑Tyr(2‑Br‑Z)‑Arg(Mts)‑Trp(For)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA中加入20％哌啶/DMF溶液，室温搅拌反应20～30分钟除Trp的甲酰基保护基，抽干，二氯甲烷，乙醇交替洗涤2～3次后，得到脱除Trp的甲酰基侧链保护基的ATL树脂：Ac‑Arg(Mts)‑Tyr(2‑Br‑Z)‑Tyr(2‑Br‑Z)‑Arg(Mts)‑Trp(H)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA；4)切割反应脱除侧链保护基团并切割树脂以10ml/g树脂的量将切割试剂加入到Ac‑Arg(Mts)‑Tyr(2‑Br‑Z)‑Tyr(2‑Br‑Z)‑Arg(Mts)‑Trp(H)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑Lys(2‑Cl‑Z)‑MBHA中，室温反应3小时后，过滤，收集滤液，用三氟醋酸洗涤滤除的树脂，洗涤液与滤液合并后浓缩，之后加入其100～150倍体积量的冷乙醚，即析出 大量的白色固体，过滤，收集白色固体，干燥，即得ATL肽的粗肽制品；其中：所述切割试剂是体积配比为：三氟醋酸∶三氟甲磺酸∶硫代苯甲醚∶乙二硫醇＝80∶8～9∶8～9∶4～5的混合溶液；5)ATL肽粗品的纯化ATL肽粗品用5％醋酸水溶液溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤后，直接上样到反相C18键合硅胶装填色谱柱，采用梯度6～9％甲醇‑水流动相进行梯度洗脱分离，收集目的组分，浓缩后，冷冻干燥，得到纯ATL肽。