H5亚型禽流感病毒核酸检测方法及其试剂盒

摘要

H5亚型禽流感病毒核酸检测方法及其试剂盒，涉及一种病毒。提供一种操作简便、实验可靠性高、可进行实时检测、灵敏度高、特异性好、周期短的H5亚型禽流感病毒核酸检测方法和试剂盒。步骤：1)寻求H5亚型禽流感病毒特有的保守序列作为待测靶基因；2)设计合成一对特异性引物，引物长度为18-30bp；3)根据保守序列设计合成一对Y型双链特异性荧光探针；4)使用步骤2中的一对特异性引物和步骤3中的Y型双链特异性荧光探针及PCR成份组成20μL荧光PCR反应体系的检测溶液，将荧光PCR反应体系的检测溶液装入PCR反应管；5)设置阳性对照模板和阴性对照模板，进行实时荧光PCR反应，获得检测结果。

主权项

H5亚型禽流感病毒的Y型双链探针核酸检测的试剂盒，其特征在于设有盒体、垫体和盒盖，垫体设于盒体内，垫体上设有至少可分别隔离放置5个离心管的凹槽，5个离心管分别装有Taq酶、反转录酶、阴性对照模板、阳性对照模板和荧光PCR反应体系的检测溶液，荧光PCR反应体系的检测溶液包括MgCl2、dNTPs、10×PCR缓冲液、引物、探针；所述阳性对照模板为包含保守序列的MS2噬菌体，所述保守序列为：catt ccacaacata caccctctca ccatcgggga gtgccccaaa tatgtgaaat caaacagattagtccttgcg actggactca gaaatacccc tcaaagagag agaagaagaa aaaagagagg actatttggagctatagcag gttttataga gggaggatgg cagggaatgg tagatggttg；所述阴性对照模板为灭菌后的无离子水；所述荧光PCR反应体系的检测溶液包括MgCl2、dNTPs、10×PCR缓冲液、引物、探针；所述引物为一对H5亚型禽流感病毒特异性引物，引物长度在18～30bp之间，一对H5亚型禽流感病毒特异引物序列为：上游引物：5′‑CAT TCC ACA ACA TAC ACC C‑3’19bp Tm＝50.7℃，下游引物：5′‑CAA CCA TCT ACC ATT CCC T‑3’19bp Tm＝51.7℃；所述探针是根据保守序列设计合成的一对Y型双链特异性荧光探针，具体要求如下：a.Y型双链特异性荧光探针的长度为18～30bp，退火温度为50～70℃；b.标记荧光剂的链与保守序列完全匹配，另一条链标记淬灭剂；c.两条链的3’端为了防止引发扩增反应需要封闭；d.两条链的一个末端存在碱基完全不匹配，不匹配的碱基长度为2～10bp。