益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定性、定量测定方法

摘要

本发明涉及一种在益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定性、定量测定方法。该方法针对益生菌乳制品中含有的干酪乳杆菌，自行设计干酪乳杆菌的16S rRNA基因序列的种属特异性引物，应用此引物进行种属特异性PCR和实时荧光定量PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳图谱分析和实时荧光定量PCR图谱分析，建立益生菌乳制品中干酪乳杆菌的简便、快速、准确的定性和定量测定方法。

主权项

一种益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定性测定方法，其特征在于该方法的步骤如下：A、模板DNA的制备(1)取益生菌干酪乳样品于2.0mL离心管中，加入500.0μL TE缓冲液，混合均匀，再置于液氮中进行完全冻结，冻结后取出放入65℃水浴中进行融化4‑6min，如此反复进行冻融3‑5次；(2)冻融结束后，往其中加入60.0μL 10％(质量体积比)SDS和10.0μL10mg/mL蛋白酶K，在摇床中在温度37℃下以200r/min进行摇动4h；(3)加入100.0μL 5M NaCl和100.0μL 10％CTAB/NaCl溶液，65℃水浴10min；(4)加入与在步骤(3)得到的溶液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇混合物，它们的体积比分别是25∶24∶1，混匀，再以10000g/min离心10min，该溶液分成上层水相、中间固相与下层有机相；(5)吸取上层水相，加入与所述水相等体积的上述苯酚、氯仿和异戊醇混合物抽提一次，分离上清液；(6)往所述的上清液中加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积的冰异丙醇，混合均匀，再静置30min，以10000g/min离心5min，得到总DNA沉淀；(7)所述沉淀用70％(体积比)乙醇水溶液洗涤2次，再在室温下自然干燥，得到模板DNA；然后加入50.0μL无菌超纯水回溶，在温度‑20℃下保存备用；B、PCR扩增反应体系25.0μL：2.5μL 10×PCR Buffer、1.0μL 25mmol/L Mg2+、2.0μL2.5mmol/L dNTPs、2.5μL 5mmol/L上下游引物、1.0μL 50ng/μL DNA模板，0.25uL 5U/μL Taq酶，二次蒸馏水补足至25.0μL；PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性40S，62℃退火30S，72℃延伸1min，循环40次；72℃延伸8min，得到PCR扩增产物，在温度4℃下保存；取3.0μL PCR产物使用1％琼脂糖凝胶进行检测；所述的上下游引物分别是：上游引物Cf为5’‑CACCGAGATTCAACATGG‑3’，下游引物Cr为5’‑GAAGGGCGGAAACCCTCC‑3’，扩增片断长度为784bp；C、结果及判断检测时设以含有目的扩增片断的质粒DNA作为模板为阳性对照，以灭菌水作为模板为阴性对照；根据在784bp处出现预期特征条带，确定该益生菌乳制品中含有干酪乳杆菌，相反地则不含有干酪乳杆菌。