皖南尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组分、提取方法及其应用

摘要

本发明公开了皖南尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组分、提取方法及其应用，所述的皖南尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组分，由分子量分别为25KDa、30KDa、50KDa的蛇毒蛋白组成。本发明的提取方法包括a)阴离子层析步骤、b)阳离子层析步骤、c)分子筛层析步骤。本发明与现有技术相比，利用阴、阳离子层析及分子筛层析，从皖南尖吻蝮蛇毒中提取一种新的抗凝活性组分，所制备的组分具有抗肿瘤及改善免疫系统功能的作用。

主权项

一种含有皖南尖吻蝮蛇蛇毒抗凝蛋白组分的提取物，包括分子量分别为25KDa、30KDa、50KDa的蛇毒蛋白，所述的蛇毒抗凝蛋白组分通过以下方法提取：a)阴离子层析步骤：将皖南尖吻蝮蛇毒粗毒溶于pH8.0±0.5的0.01±0.005mol/L Tris‑Hcl溶液中，6000±1000rpm离心，取上清液适量上DEAE琼脂糖凝胶FF柱，用pH8.0±0.5的0.01±0.005mol/L Tris‑Hcl溶液与含有0.5±0.05mol/L NaCl的0.01±0.005mol/L Tris‑Hcl溶液进行梯度洗脱，温度为0℃～10℃，流速为0.5±0.1ml/min，5‑20min收集一管，用紫外检测仪进行检测，记录层析图谱，根据图谱收集各峰洗脱液，测定各峰的抗凝活性，选取抗凝时间延长最明显的峰，收集此峰各管洗脱液，装入透析袋，脱盐浓缩得到蛇毒蛋白1，皖南尖吻蝮蛇毒粗毒与DEAE琼脂糖凝胶FF的g/ml比为1∶15‑25；b)阳离子层析步骤：将蛇毒蛋白1于6000±1000rpm离心，取上清液适量上SP琼脂糖凝胶FF柱，用pH6.7±0.5的含有0.1±0.05mol/L NaCl的0.05±0.005mol/L NaH2PO4300ml的溶液与含有0.5±0.05mol/L NaCl的0.05±0.005mol/L NaH2P04溶液进行梯度洗脱，温度为0℃～10℃，流速为0.5±0.1ml/min，5‑20min收集一管，紫外检测仪进行检测，记录层析图谱，根据图谱收集各峰洗脱液，测定各峰的抗凝活性，选取抗凝时间延长最明显的峰，收集此峰各管洗脱液，装入透析袋，脱盐浓缩得到蛇毒蛋白2，蛇毒蛋白1与SP琼脂糖凝胶FF的体积比为1∶50‑80；c)分子筛层析步骤将蛇毒蛋白2于6000±1000rpm离心，取上清液适量上Sephadex G75柱，用生理盐水进行洗脱，温度为0℃～10℃，流速为0.5±0.1ml/min，5‑20min收集一管，用紫外检测仪进行检测，记录层析图谱，根据图谱收集各峰洗脱液，测定各峰的抗凝活性，选取抗凝时间延长最明显的峰，收集此峰各管洗脱液，装入透析袋，脱盐浓缩得到蛇毒抗凝蛋白组分，蛇毒蛋白2与Sephadex G75干粉的ml/g比为1∶40‑60。