一种提取单个鱼卵仔鱼微量总DNA的简便快速方法

摘要

本发明涉及一种DNA提取技术，具体地说是一种提取单个鱼卵仔鱼微量总DNA的简便快速方法。对采集的鱼卵或仔鱼进行固定保存。冲洗去除固定液后，加入DNA提取缓冲液和细胞裂解缓冲液，将鱼卵或仔鱼剪碎后再加入蛋白酶K和RNA酶，温育消化。用高浓度NaCl溶液沉淀蛋白质，加入异丙醇沉淀DNA，用70％乙醇洗涤沉淀去除盐离子，待乙醇挥发后加入超纯水或TE溶液溶解。本方法解决了常规总DNA提取方法在鱼卵或仔鱼等基因组DNA含量较少样品中应用的限制问题。

主权项

一种提取单个鱼卵仔鱼微量总DNA的简便快速方法，其特征在于：1)样品固定：采集鱼卵或仔鱼，滤去水后立即加入无水乙醇，而后于‑20℃或室温保存备用，鱼卵或仔鱼与无水乙醇比例为：1mL鱼卵/2‑5mL无水乙醇；1尾仔鱼/0.05‑0.5mL无水乙醇；2)样品中固定液的去除：取步骤1)所得已固定的单个鱼卵或仔鱼样品，加入生理盐水洗涤，1000‑2000g离心20‑60秒去除多余生理盐水，再用滤纸吸干样品，重复2‑3次；3)样品消化：取上述洗涤过的单个鱼卵或仔鱼，加入100‑300μL DNA提取缓冲液和10‑30μL细胞裂解缓冲液，使细胞破壁，而后将细胞破壁的单个鱼卵或仔鱼加入10‑100μg蛋白酶K和10‑100μg RNA酶，震荡混匀，于50‑70℃温育，每10‑20分钟颠倒混匀一次，消化至溶液澄清，待用；4)提取总DNA：将步骤3)消化至澄清的溶液中加入100‑300μL 5‑6mol/L NaCl溶液，震荡20‑30秒。15000g离心30分钟，吸取上清液使蛋白质去除，然后在上清液中加入等体积异丙醇，轻轻混匀，‑20℃静置1‑2小时，15000g离心15分钟，沉淀即得到单个鱼卵仔鱼微量总DNA。