多种重要水源性人兽共患原虫同时检测试剂盒及制备方法

摘要

本发明公开一种多种重要水源性人兽共患原虫同时检测试剂盒，本发明还提供了该试剂盒的制备方法，利用多重荧光定量PCR特异性检测方法，根据蓝氏贾第虫、微小隐孢子虫和刚地弓形虫种特异基因序列设计引物与探针，通过优化荧光定量PCR反应体系和条件来提高其敏感性，扩增同时可直接实时观察扩增结果。本发明可同时对三种重要水源性人兽共患原虫进行快速准确的检测，具有设计严谨，简单易操作，灵敏度高，特异性强，判定准确客观等特点。

主权项

一种多种重要水源性人兽共患原虫同时检测试剂盒，包括以下部分：（1）样本裂解液与DNA提取试剂样本裂解液：NaCl、Tris‑HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；其中，浓度配比为：NaCl 100mM、Tris‑HCl(pH 7.5)20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2%（w/v）和蛋白酶K 0.1μg/μl；DNA提取试剂为酚:氯仿:异戊醇（24:25:1）；（2）荧光定量PCR反应液：含反应终浓度各100‑300μM的4种dNTPs，反应终浓度各10‑100pmol/μl的引物，反应终浓度为10‑100pmol/μl的探针，1.5‑4.5mM的Mg2+浓度；DNA聚合酶，灭菌蒸馏水；（3）多重引物及探针：蓝氏贾第虫：Ga：5'‑ GGCATCTTCATTCATAGACCTTCTG ‑3'Gs：5'‑ATATGCTGACATCTGGAGGAAAATC‑3'G‑probe：5'‑FAM‑TCTTCCGTCTCGCCGTAACTGGTAA‑BHQ1‑3'微小隐孢子虫：Ca：5'‑ATTGAAATAGATTCTGGTCCTTTGG‑3'Cs：5'‑CATATTCCCTGTCCCTTGAGTTG‑3'C‑probe：5'‑JOE‑CCGACCTCTCTCTCATTTGGTGACC‑BHQ1‑3'刚地弓形虫：Ta：5'‑ATTTGCCAGCGGGAAATACAG‑3'Ts：5'‑CCACAAGACGGCTGAAGAATG‑3'T‑probe：5'‑Cy5‑TTCTTGTGCTGCCTCCTCTCATGG‑BHQ2‑3'；（4）阳性对照：蓝氏贾第虫、微小隐孢子虫和刚地弓形虫检测片段标准质粒；（5）阴性对照：取灭菌蒸馏水为阴性对照样本；（6）多重荧光定量PCR标准曲线：通过阳性标准质粒进行荧光定量PCR扩增绘制。