溶解血小板栓块的基因工程制剂的制备方法及其应用

摘要

本发明涉及生物制药中应用基因工程技术生产蛋白质药物领域，特别是一种新的具有快速溶解动脉血栓团块中血小板成分的人源化单克隆抗体(A11)和解整合素金属蛋白酶-18羧基端重组蛋白（AD18C）的制备方法和应用。其制备方法是应用基因工程技术构建了表达A11及ADAMTS-18C的重组质粒，并实现了其在大肠杆菌中的高效表达。经分离纯化后获得高纯度的具有快速溶解动脉血栓团块中血小板成分的人源化基因工程抗体及重组蛋白，可用于脑卒中、急性心肌梗塞等动脉血栓相关性疾病的治疗。

主权项

一种溶解血小板栓块的基因工程制剂的制备方法，其特征在于该方法包括：a）人源性抗体A11工程菌的构建将从噬菌体抗体文库中获得的能特异性识别血小板整合素β3亚基第49‑66表位的噬菌体‑A11基因用限制性内切酶Noc I 和Not I双酶切后插入到表达质粒pET29a中，构建成重组质粒pET29a‑A11；将重组后的表达质粒pET29a‑A11转化宿主菌BL21(DE3) pLysS获得能稳定分泌人源性抗体A11工程菌；b）解整合素金属蛋白酶‑18羧基端重组蛋白AD18C工程菌的构建通过多聚酶链式反应法，扩增人源性解整合素金属蛋白酶18蛋白羧基端基因；通过限制性内切酶Nde I 和Not I双酶切后插入到表达质粒pGEX‑4T2中，构建成重组质粒pGEX‑4T2‑AD18C840‑1221；将重组后的表达质粒pGEX‑4T2‑AD18C840‑1221转化宿主菌BL21(DE3) pLysS获得能稳定分泌人源性重组蛋白AD18C工程菌；c）制备溶解血小板栓块的基因工程制剂ⅰ）将步骤a）或步骤b）中的人源性抗体A11或人源性重组蛋白AD18C工程菌于LB培养基中37℃培养过夜，按1:50比例转接后继续培养至光密度值OD600nm≈0.6，加1mM 异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷诱导4个小时进行诱导表达，获得含目的蛋白的菌体；将已知重量的菌体，按10ml/g湿重比例加入裂解液，搅拌均匀，于4℃进行超声破菌，12000 r/min离心30min获得包涵体；其中：裂解液为：100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、2mmol/L乙二胺四乙酸、100 mM/L氯化钠， pH 7.0；ⅱ）将步骤ⅰ）的包涵体进行复性处理，取包涵体悬浮在9倍体积的洗涤缓冲液中，洗涤3次；取洗涤后的湿包涵体按10mL/g比例加入变性缓冲液，37℃变性3h，4℃，8000r/min离心30min，取上清，按1/40比例逐步稀释到含有不同浓度的盐酸胍、氯化钠、尿素、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽的复性缓冲液中，4℃搅拌30 min后，静置18 h获得包涵体复性产物上清液；其中：洗涤缓冲液为：100 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，2 mmol/L乙二胺四乙酸盐，0.005/L Triton，2 mol/L 尿素，pH7.0；变性缓冲液为：50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，6 mmol/L盐酸胍，5 mmol/L 乙二胺四乙酸盐，100 mmol/L 巯基乙醇，pH8.0；ⅲ）将步骤ⅱ）的包涵体复性产物上清液通过Ni‑NTA亲和柱（A11）或谷胱甘肽‑S‑转移酶（GST）亲和柱（AD18C）进行纯化，获得溶解血小板栓块的基因工程制剂，该制剂为基因工程抗体或重组蛋白。