一种制备小牛胸腺alpha1的新工艺

摘要

本发明公开了一种制备小牛胸腺alpha 1(天然存在于小牛等动物胸腺细胞中)的新工艺。本发明利用Fmoc-策略固相法制备胸腺alpha 1的新工艺。包括以下步骤：a.RinkAmide PEGA树脂或Rink Amide AM树脂或Rink Amide MBHA树脂或Rink AmidePEGA树脂其中的任何一种为起始原料，用Fmoc保护的氨基酸为单体挂上树脂后，按照固相合成的方法依次连接各种保护氨基酸得到保护二十八肽树脂；b.其间依次用醋酐封头；c.其间依次脱去Fmoc-保护基团；d.脱侧链保护基团及切肽同步进行，得粗品；e.粗品经反相HPLC分离纯化，制得胸腺肽α1精品。本发明具备规模生产能力，工艺简单，成本低，三废少，质量上乘(纯度≥98％)。接肽收率高(每步接肽收率为≥99％)。总收率约为：12％，便于工业化实施，具有产业化前景。

主权项

一种制备小牛胸腺alpha 1的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以Rink Amide PEGA树脂、Rink Amide AM树脂或Rink Amide MBHA树脂其中的任何一种为起始原料，在接肽试剂中，与Fmoc‑Asp(R2)‑R3加缩合剂进行接肽反应，逐个接上氨基酸，其间依次加入醋酐进行乙酰化封头反应、加入脱帽试剂进行脱帽反应，脱去Fmoc‑保护基团，获得保护二十八肽树脂；其中：R2＝‑OH，‑OAll，‑OMe，‑OEt，‑OPr，‑OBu，‑OtBu，‑OBzl或OcHx；R3＝‑OH，‑OAll，‑OMe，‑OEt，‑OPr，‑OBu，‑OtBu，‑OBzl，OcHx或‑Opfp；所说的接肽试剂为：NMM或DIPEA中的一种和DMF，NMM或DIPEA和DMF的体积比为：NMM或DIPEA∶DMF＝1∶5～15；所说缩合剂为：TBTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt及或TBTU/HOAt或HBTU/HOAt或BOP/HOAt其中的任何一种为缩合剂：第一种，TBTU/HOBt，第二种HBTU/HOBt，第三种，BOP/HOBt，第四种TBTU/HOAt，第五种，HBTU/HOAt，第六种，BOP/HOAt；所说的脱帽试剂为六氢吡啶的DMF溶液；(2)加入切肽试剂进行切肽，得胸腺肽α1粗品；(3)在C18柱或C8中进行分离纯化，获得目标产物；所述的六氢吡啶的重量浓度为15～55％，以被脱帽树脂的重量为基准，脱帽试剂的用量为5～20毫升/克；接肽反应温度为15～55℃，反应时间为0.5～3小时；乙酰化封头反应温度为15～55℃，反应时间为0.5～3小时；脱帽反应温度为15～55℃，反应时间为10～50分钟；以被封头的树脂的重量为基准，醋酐的用量为2～20毫升/克；所述的保护二十八肽树脂的制备方法，包括如下步骤：(1)将原料树脂Rink Amide AM树脂、Rink Amide MBHA树脂或Rink Amide PEGA树脂其中的任何一种用DMF浸泡0.5～2小时，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得A；(2)然后加入Fmoc‑Asp‑OtBu和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得B；NMM或DIPEA和DMF的混合溶液中：A的重量浓度为5～20％，Fmoc‑Asp‑OtBu的摩尔数为A的2～5倍，TBTU、HBTU或BOP的摩尔数为A的2～5倍，HOBT或HOAT的摩尔数为A的2～5倍；(3)在B中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，加Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干：加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得C；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：B的重量浓度为5～20％：Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(4)在步骤3的C中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干；加入Fmoc‑Ala‑OH，MW：311.3和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得D；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：C的重量浓度为5～20％：Fmoc‑Ala‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(5)在步骤4的D中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，加入Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得E；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：D的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(6)在步骤5的E中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干；加Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得F；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：E的重量浓度为5～20％：Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH的重量为摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(7)在步骤6的F中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干；加Fmoc‑Val‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得G；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：F的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Val‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(8)在步骤7的G中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干；加Fmoc‑VaI‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得H；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：G的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Val‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(9)在步骤8的H中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DIVIF洗涤，氮气吹干；加Fmoc‑Glu(OtBu)和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得I；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：H的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Glu(OtBu)的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(10)在步骤9的I中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干；加Fmoc‑Lys(Boc)‑OH，FW：468.5和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得J；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：I的重量浓度为5～20％：Fmoc‑Lys(Boc)‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍：TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(11)在步骤10的J中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，加Fmoc‑Lys(Boc)‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得K；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：J的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Lys(Boc)‑OH摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍：HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(12)在步骤11的K中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，加Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得L：NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：K的重量浓度为5～20％：Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2‑5倍；(13)在步骤12的L中加入脱帽试剂，脱帽反应，氨气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，加Fmoc‑Lys(Boc)‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得M；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：L的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Lys(Boc)‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(14)在步骤13的M中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，加Fmoc‑Leu‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氨气吹干，用DMF洗涤，获得N；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：M的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Leu‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(15)在步骤14的N中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，加Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干：加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得O；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：N的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍：HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(16)在步骤15的O中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，加Fmoc‑Lys(Boc)‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得P；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：O的重量浓度为5～20％：Fmoc‑Lys(Boc)‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(17)在步骤16的P中加入脱帽试剂，20‑30℃脱帽反应10‑50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，加Fmoc‑Thr(tBu)‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得Q；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：P的重量浓度为5～20％：Fmoc‑Thr(tBu)‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(18)在步骤17的Q中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹于，用DMF洗涤，氮气吹干，加Fmoc‑Thr(tBu)‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得R；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：Q的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Thr(tBu)‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(19)在步骤18的R中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，加Fmoc‑Ile‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得S；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：R的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Ile‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；醋酐的DMF溶液中，醋酐的重量浓度同上；(20)在步骤19的S中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，加Fmoc‑Glu(Otlu)‑OH和接肽试剂，15～55℃接肽反应0.5～3小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得T；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：S的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(21)在步骤20的T中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，加Fmoc‑Ser(tBu)‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得U；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：T的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Ser(tBu)‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2‑5倍；HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(22)在步骤21的U中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，加Fmoc‑Ser(tBu)‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干：加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得V；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：U的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Ser(tBu)‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍：HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(23)在步骤22的V中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干；加Fmoc‑ThrtBu)‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得X；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：V的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Thr(tBu)‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍：HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(24)在步骤23的X中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，加Fmoe‑Asp(OtBu)‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得Y；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：(X)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍：TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(25)在步骤24的Y中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，加Fmoc‑Val‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得Z；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：Y的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Val‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(26)在步骤25的Z中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气干，加Fmoc‑Ala‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得Z1；NMM或DII′EA与DMF的混合溶液中：Z的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Ala‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(27)在步骤26的Z1中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，加Fmoc‑Ala‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得Z2；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：Z1的重量浓度为5‑20％；Fmoc‑Ala‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍：HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(28)在步骤27的Z2中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干；加Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，用DMF洗涤，氮气吹干，获得Z3；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：Z2的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(29)在步骤28的Z3中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，加Fmoc‑Ser(tBu)‑OH和接肽试剂，接肽反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得Z4；NMM或DIPEA与DMF的混合溶液中：Z3的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Ser(tBu)‑OH的摩尔数为树脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩尔数为树脂的2～5倍：HOBT或HOAT的摩尔数为树脂的2～5倍；(30)在步骤29的Z4中加入脱帽试剂，脱帽反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，加入醋酐乙酰化反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干，甲醇洗涤，干燥，获得保护的28肽树脂。