检测食品沙门氏菌的Taqman探针荧光定量PCR方法

摘要

本发明涉及一种检测食品沙门氏菌的Taqman探针荧光定量PCR方法。针对fimY基因设计引物和Taqman探针，荧光定量PCR。在优化的反应程序和反应体系下，以水煮裂解法提取的肠炎沙门氏菌标准菌株10倍系列稀释液的基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR，绘制标准曲线，根据线性关系R2和扩增效率E来衡量重复样品数据是否一致和不同拷贝数的初始模板是否具有相同的扩增效率。应用本发明建立的方法，对人工污染的猪肌肉和鸡蛋样本进行检测，该方法能在最高浓度为14.8×108cfu/ml干扰菌的存在下，在1～3cfu/10g的接种浓度上检出阳性。本发明使用fimY基因特异引物和Taqman探针，在优化的反应条件下检测食品中污染的沙门氏菌时，具有更高的稳定性、特异性和灵敏性，是一种快速、准确的沙门氏菌检测方法。

主权项

一种荧光定量PCR检测食品中沙门氏菌的方法，其步骤如下：A、以水煮裂解法提取肠炎沙门氏菌基因组DNA：取菌悬液1ml于10000rpm离心5min，沉淀重悬于300μl无菌三蒸水中，混匀，置沸水浴中裂解20min；然后置‑20℃冷冻5min，10000rpm离心5min，所得上清液即为所述的肠炎沙门氏菌基因组DNA样品，取所述的上清液5μl作反应模板；B、根据沙门氏菌fimY基因序列设计合成引物及Taqman探针；所述的引物的核苷酸序列如下所示：F1  GCGCTACCTGTCTCCTGTATTGA，F2  ACGCCCAGCCATACGGATA；所述的Taqman探针的核苷酸序列如下所示：FP3  AGCTACGCGCGCTCAGTTGGCA；其中：探针FP3的5’端标记有FAM荧光报告基团，3’端标记有TAMRA基团；C、将步骤B所述的引物和探针与反应试剂组合，进行荧光定量PCR反应，其反应体系为25μl，体系组成：反应缓冲液为10×Taq PCR buffer，Mg2+浓度为3.5mM，dNTPs浓度为0.2mM，Taq酶2.5U，引物F1和F2的浓度均为0.1μM，探针FP3浓度为0.4μM，肠炎沙门氏菌基因组DNA 5μl，无菌水9μl；其PCR反应程序：94℃变性3min，以95℃5s 56℃20s扩增40个循环，最后25℃3min保温，在56℃进行单点荧光检测。