胚胎源性多能干细胞向心脏起搏细胞定向诱导分化的方法

摘要

本发明涉及干细胞诱导分化技术领域。目前构建生物心脏起搏器的细胞移植方法主要是以胚胎源性干/祖细胞和成体间充质干细胞作为细胞来源。本发明利用胚胎源性多能干细胞定向诱导分化心脏起搏细胞，采用全骨髓直接贴壁法获得原代培养的细胞，按有限稀释法进行克隆培养获得该细胞的纯化系，通过施加旁分泌因子内皮素-1或神经调节蛋白-1，胞外基质组分层粘连蛋白、纤维连接蛋白等基质胶；同时转染转起搏基因HCN4的方法体外诱导胚胎源性多能干细胞向起搏细胞方向分化。本发明提供一种供给广泛、无免疫原性、不涉及伦理学问题的起搏细胞来源，为临床治疗病态窦房结综合症等缓慢性心率失常带来希望。

主权项

一种犬胚胎源性多能干细胞向心脏起搏细胞定向诱导分化的方法，其特征在于该方法包括：I.胚胎源性多能干细胞的分离、培养、鉴定采用全骨髓直接贴壁法获得原代培养的细胞，然后按有限稀释法进行克隆培养获得该细胞的纯化系，通过对CD133、SSEA‑1、CD45、Oct‑4和Nanog标记物的检测进行鉴定；II.胚胎源性多能干细胞向心脏起博细胞的诱导分化将Matrigel基质胶在4℃缓慢溶解，DMEM中稀释1∶30，胶溶液800μl/孔涂于六孔板，37℃孵育2小时，在培养细胞前弃掉胶溶液；在上述六孔板中培养胚胎源性多能干细胞，接种密度为105个/ml，加入旁分泌因子内皮素‑1或神经调节蛋白‑1，使其终浓度为10‑8M，连续培养5天。