一种纤维素酶的制备方法

摘要

一种纤维素酶的制备方法，其包括以下步骤：(1)培养皿液体菌种制备；(2)三角瓶种曲培养；(3)固态厚层通风发酵培养；(4)精制提纯。本发明采用制备液体菌种、固态厚层通风发酵培养制取高活力纤维素酶，在不增加生产成本前提下，酶活力可以达到90000IU/g以上。

主权项

一种纤维素酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)培养皿液体菌种制备：试管斜面菌种为绿色木霉；试管培养基配方，(NH4)2SO4 0.2‑0.5g，NaNO3 0.1‑0.2g，K2HPO4 0.1‑0.15g，MgSO4·7H2O 0.05‑0.08g，琼脂1.0‑1.5g，自来水99‑101mL，合计总重102g；所述配料混匀后分放于培养皿，0.1MPa灭菌30‑35min，备用；接种与培养：将试管斜面菌种用接种环移取一环于无菌水中，制成孢子悬浮液，接种于培养皿，置于30℃±1℃恒温培养70‑72h，取出保存；(2)三角瓶种曲培养：培养基制备，培养基配方为：麸皮75‑85g，米糠15‑25g，(NH4)2SO40.25‑0.35g，NaNO30.10‑0.15g，MgSO40.05‑0.10g，K2HPO40.05‑0.10g，水1480‑1520mL，合计总重1600g；制备：将麸皮和米糠拌匀，计算好水量，将(NH4)2SO4、NaNO3、MgSO4、K2HPO4溶于水，拌入麸皮和米糠混合料，搅匀后，装入已灭菌三角瓶，每500mL三角瓶装湿料40‑50g，0.1Mpa灭菌30‑35min，冷却，备用；接种与培养：将培养皿菌种接入所述三角瓶培养基中，置于30℃恒温箱培养70‑72h，长好后取出，在40℃下干燥，备用；(3)固态厚层通风发酵培养：培养基配方：麸皮70‑80g，米糠15‑20g，羧甲基纤维素0.15‑0.2g，(NH4)2SO40.05‑0.1g，MgSO40.05‑0.10g，K2HPO40.1‑0.15g，水1480‑1520mL，合计总重1600g；制备：先将羧甲基纤维素、(NH4)2SO4、MgSO4、K2HPO4溶解于水中，调pH至4.5，拌入麸皮米糠混合料，搅拌均匀，于常压下，95‑100℃杀菌1h，闷料30‑40min；接种与培养：待麸皮米糠混合料冷却至30‑38℃时，将三角瓶曲种接入拌匀，以麸皮米糠混合料重量为计算基数，接种量为0.35wt％～0.45wt％；装箱温度为30～35℃，厚度25～35cm，在整个培养过程中，控制品温30～37℃；根据整个培养过程合理使用室内循环风和新鲜风比例，控制室内相对湿度为85％‑95％，培养时间40～50h，出箱后，打碎晾干，成曲纤维素酶活力在6000IU/g干粉以上；(4)精制提纯：将麸曲先经粉碎，用2.5‑3.5倍重量的水在30～35℃温度下浸泡1.5‑2h后，压滤，取得酶液再重复浸麸曲，再经压滤，取得酶液，用10‑15％的HCl调节pH至2.9‑3.1，在10‑20℃下静置0.4‑0.6h，静置后离心，取上层清液再将pH调至4.3‑4.5，同时将酶液和酒精分别冷却至5～7℃；将酶液倒入乙醇内搅匀，使酶液浓度保持在60‑65wt％，沉淀1.8‑2.2h，待沉淀完全后，用离心机离心，分离沉淀，取得沉淀再用96％乙醇洗涤2～3次，在25‑30℃的低温下干燥，粉碎，即得纤维素酶粉剂。