一种海洋内生拟盘多毛孢菌生产漆酶的液体发酵方法

摘要

本发明公开了一种海洋内生拟盘多毛孢菌生产漆酶的液体发酵方法。方法的步骤为：(1)菌种筛选：从东海近海10～20m深处的泥土里筛选得到一株新型海洋真菌；(2)菌种保藏：菌种接种于修饰的PDA培养基中培养，并于4℃下斜面保藏；(3)菌种活化和扩培：菌种的孢子接种于添加了特殊成分的PDA培养基，活化得到的孢子接种于种子培养基中进行扩培；(4)制备海洋内生拟盘多毛孢菌液体发酵培养基；(5)发酵：采用新配制的培养基进行液体发酵和产酶，确定了优化的产酶条件。本发明所开发的生产漆酶的方法，以新型的海洋内生拟盘多毛孢菌为产生菌，具有培养基粗狂、来源广泛和价廉等特点。

主权项

一种海洋内生拟盘多毛孢菌生产漆酶的液体发酵方法，其特征在于它的步骤如下：1)菌种筛选：从东海10～20m深的海水底取污泥、海草样品，取样品5～10g加入灭菌人工海水50ml，160～250r/m转速下振荡20～30min，静置10～20min取上清液0.25～0.5ml，涂布PDA平板，26～30℃，培养15～20天；挑取菌落，接种于分离选择培养基，26～30℃培养，若分离得到产漆酶的菌株，则会在含愈创木酚的选择培养基上因愈创木酚的氧化而显示出红棕色，颜色越深，范围越大表明菌株产漆酶的能力越强，将产漆酶的菌株接种于液体产酶培养基进行发酵培养，26～30℃培养8～12天测定漆酶活，选取漆酶活力高的为目的菌种，依据菌种的ITS分析和菌种的形态特征鉴定，得到一株新型的海洋真菌‑海洋内生拟盘多毛孢菌作为发酵菌种，其中，分离选择培养基的组成为：愈创木酚1g，酒石酸铵0.1g，蛋白胨2.6g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 1g，Na2HPO4 0.2g，琼脂18g，加人工海水至1000ml，菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010300，保藏日为2010年11月13日，分类命名为pestalotiopsissp.j63；2)菌种保藏：把内生拟盘多毛孢菌接种于PDA培养基上，26～30℃下培养6～10天，斜面保藏于4℃，保藏期限为30天，保藏30天后重复传代保藏；3)菌种活化：在PDA培养基中添加新的成分形成PDA‑a培养基，新添加的成分为200g马铃薯经1升人工海水煮沸30min后的滤液和葡萄糖10～20g，在26～30℃下培养6～10天，完成活化，得到活化的内生拟盘多毛孢菌，人工海水组成为：NaCl 29.8g，MgSO4 5.4g，KCl 0.73g，MgCl2.6H2O 10.7g，CaCl2 0.8306g，蒸馏水1.0L；4)种子培养基：将活化的内生拟盘多毛孢菌株挑取少量菌丝接种到种子培养基中进行扩培，得到内生拟盘多毛孢菌的一级种子液，种子培养基的组成为：葡萄糖6～12g，酒石酸铵1～4g，KH2PO4 0.5～2g，Na2HPO4 0.2g，微量元素液5～15ml，酵母提取物：1～4g，调pH至4.5～6.0，用人工海水定容至1000ml，26～30℃下培养2～4天，其中，微量元素溶液的组成为：MgSO4·5H2O 0.5g/L，FeSO4 0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.01g/L，MnCl2·4H2O 0.003g/L，H3BO4 0.03g/L，CoCl2·6H2O 0.02g/L；5)发酵产酶培养基：内生拟盘多毛孢菌的一级种子液按5～10％体积比接种量接种于液体发酵产酶培养基，温度26～30℃、装液量30～40％、起始pH 4.5～6.0、转速120～200r/m发酵6～10天，得到4757IU/ml的漆酶；其中，液体发酵产酶培养基组成为：不同的碳源组合，酒石酸铵1～4g，KH2PO4 0.5～2g，Na2HPO4 0.2g，CuSO4·5H2O150～250μM，微量元素液10～15ml，酵母提取物1～4g，调pH至4.5～6.0，用自来水定容至1000ml。