一种同时检测原料乳中多种致病菌的方法

摘要

一种同时检测原料乳中多种致病菌的方法，它涉及了一种检测原料乳中细菌的方法。本发明解决了现有检测原料乳中致病菌的方法中存在不能同时检测多种致病菌、耗时长、费用高或不适用于检测牛乳的问题。本发明同时检测原料乳中多种致病菌的方法按照如下步骤进行：一、将待检测的原料乳去除脂肪；二、将步骤一保温后的样品过滤；三、收集洗脱液；四、进行多重PCR并对凝胶成像系统进行分析；即得到检测结果。本发明的试剂盒由Taq酶溶液、多重PCR反应液、阴性对照液和阳性对照液组成。本发明的方法具有耗时短、费用低、适用于检测牛乳和检测结果准确的优点。本发明的试剂盒使用方便。

主权项

一种同时检测原料乳中多种致病菌的方法，其特征在于同时检测原料乳中多种致病菌的方法按照如下步骤进行：一、将200mL待检测的原料乳以3000g的离心力离心15min，去除上层的脂肪，得到不含脂肪的样品，向样品中加入30mL、体积浓度为50％的EDTA‑2Na溶液，在37℃的水浴中保温30min；二、将步骤一保温后的样品通过蔡氏过滤器进行过滤，过滤后的滤膜剪成碎片，放入干燥无菌的烧瓶，向烧瓶中加入20mL的生理盐水，放在漩涡振荡器上震荡洗脱2min；三、收集洗脱液，以10000g的离心力离心5min，取下层菌体沉淀用1mL的灭菌双蒸水溶液重新悬浮，再以10000g的离心力离心5min，弃去上清液，即得到菌体；四、利用细菌基因组试剂盒提取细菌基因组DNA作为多重PCR模板，最后进行多重PCR，然后以2％凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，并以凝胶成像系统进行分析；即得到检测结果；步骤四50μL多重PCR反应体系由44μL的多重PCR反应液、2μL浓度为2.5U/μL的Taq酶溶液和4μL的DNA模板组成；其中44μL的多重PCR反应液由5μL的10×PCR buffer、3μL浓度为10‑2mol/L的dNTPs、8μL的引物液和28μL的灭菌双蒸水组成，引物液中含有单增李斯特氏菌引物2.5×10‑11mol、沙门氏菌引物1.25×10‑11mol、金黄色葡萄球菌引物2.5×10‑11mol、大肠杆菌O157:H7引物1.25×10‑11mol和蜡样芽孢杆菌引物2.5×10‑11mol；扩增反应条件为预变性95℃5min，变性94℃50s，退火59℃50s，延伸72℃50s，共40个循环，延伸70℃10min；单增李斯特菌上游引物为5’‑CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA‑3’，单增李斯特菌下游引物为5’‑TGCAAGTCCTAAGACGCCA‑3’，沙门氏菌上游引物为5’‑ACTCTGCCGGGATTCCCACT‑3’，沙门氏菌下游引物为5’‑CAGTCCTAACGACGACCCTTCT‑3’，金黄色葡萄球菌上游引物为5’‑AAGGGCAATACGCAAAGAGGT‑3’，金黄色葡萄球菌下游引物为5’‑AATGCACTTGCTTCAGGACCATA‑3’，大肠杆菌O157:H7上游引物为5’‑AACAGGAGGTGTCAGTAGGGAAGC‑3’，大肠杆菌O157:H7下游引物为5’‑CCCCATCATCGCCGTATAGTC‑3’，蜡样芽孢杆菌上游引物为5’‑TGGACAAACTCAAACTCAAACGAC‑3’，蜡样芽孢杆菌下游引物为5’TGTTACTCCACCGATTACAGCGT‑3’。