主权项 |
一种胃液中miRNA的检测方法,其特征在于包括下述步骤:a、胃液抽取和中和:用胃管抽取空腹胃液5ml,放入离心管中,置于冰上,然后加入质量百分浓度为20%的氢氧化钠溶液0.5ml,置摇床中常温振摇20分钟,用质量百分浓度为20%的氢氧化钠溶液调整pH值至7.0±0.5,再加入质量百分浓度为1%的胰蛋白酶溶液20μl,漩涡混匀,置37℃水浴箱中消化15分钟,4℃下,1000rpm离心20分钟;b、RNA释放:取步骤a的上清液200μl置于消毒离心管中,加入50μl灭菌的焦碳酸乙二酯处理过的双蒸水,混匀,再加入Trizol溶液1ml,反复吹打20次,室温下静置10分钟, 4℃下,12000rpm离心15分钟;c、氯仿提取:将步骤b的上清液移入另一消毒离心管中,加入0.2ml氯仿,漩涡振荡15秒,室温下静置5分钟,4℃下,12000rpm离心15分钟,吸取上层水相移入焦碳酸乙二酯处理过的灭菌离心管中;d、异丙醇沉淀:在步骤c的灭菌离心管中加入与所述上层水相等体积的异丙醇,混匀,室温下静置20分钟,4℃下,12000rpm离心15分钟,弃上清得沉淀;e、乙醇洗涤:在步骤d的沉淀中,加入质量百分浓度为75%的乙醇1ml,颠倒混匀20次洗涤,4℃下,12000rpm离心3分钟,弃上清,再用同浓度和同量的乙醇同样重复洗涤一次,4℃下,12000rpm离心3分钟,弃上清,室温下干燥10分钟,加15μl双蒸水溶解,得到RNA提取液,‑80℃保存备用;f、RNA逆转录:用miScript 逆转录试剂盒对步骤e的RNA提取液进行逆转录反应,得到cDNA溶液,置‑20℃保存备用,具体操作依该试剂盒说明书进行;g、PCR检测:用miScript SYBR Green PCR检测试剂盒对步骤f的cDNA溶液进行PCR扩增反应,扩增的上游引物为miRNA特异性扩增上游引物或小RNA U6特异性扩增上游引物,扩增的下游引物为小RNA通用下游引物,再用荧光定量PCR仪检测,具体操作依检测试剂盒和荧光定量PCR仪说明书进行。 |