一种鱼过敏原标准物的制备方法

摘要

一种鱼过敏原标准物的制备方法，属于生物技术领域。本发明涉及从鱼中将小清蛋白这种过敏原物质进行有效的提取、分离和纯化的方法，所述小清蛋白的提纯采取低温搅拌浸提、分级盐析、低温离心和凝胶过滤层析等多种技术相结合的手段，将高致敏性蛋白组分从鱼中分离出来，最大程度的保留了蛋白质的生物活性。本发明方法获得的蛋白质有助于鱼过敏的诊断并可用于免疫学来检测食品中的鱼过敏原物质。

主权项

一种鱼过敏原标准物的制备方法，其特征在于制备步骤为：（1）脱脂鱼肉捣碎均质后，用60～90℃石油醚脱脂，按鱼肉质量︰石油醚体积比W/V为1︰10，在低于60℃下进行搅拌萃取12h，4℃ 6000r/min离心15min，弃上清，沉淀置于通风橱使石油醚挥发，得脱脂鱼肉；（2）浸提将脱脂鱼肉溶解于4℃预冷的0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液中，鱼肉质量︰磷酸盐缓冲液体积比W/V为1︰20，4℃磁力搅拌4h，4℃ 7000r/min离心20min，收集上清，得鱼蛋白浸提液；（3）加热将鱼蛋白浸提液加热但不沸腾，加热30min后，4℃ 7000r/min离心20min，收集上清；去除了不耐热杂蛋白，得耐热鱼蛋白浸提液；（4）饱和硫酸铵分级沉淀在所得耐热鱼蛋白浸提液中缓慢加入硫酸铵，边加边搅拌，直至溶液中硫酸铵饱和度达30%，4℃磁力搅拌1h、静置1h，4℃ 8000r/min离心20min，离心后的上清液中继续缓慢加入硫酸铵直至饱和度达50%，4℃磁力搅拌1h、静置1h，4℃ 8000r/min离心20min，收集沉淀，用0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液复溶；（5）凝胶过滤层析将50%饱和度的蛋白组分装入透析袋，用0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液于4℃透析48h，然后使用AKTA蛋白纯化系统进行凝胶过滤层析；条件：经Superdex 75 10/300 GL凝胶柱层析，以0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液进行洗脱，流速0.4mL/min，2mL间隔自动收集，280nm紫外吸收监测，收集所需出峰样品，合并后于4℃超纯水透析24h；样品冷冻干燥后即为所制备的鱼过敏原蛋白标准品。