原位构建基因突变文库的方法及试剂盒

摘要

本发明为基因定向进化提供一种快速、通用的原位构建基因突变文库的新方法，以及应用该方法构建基因突变文库的试剂盒。该方法具有以下特点：(1)极耐热性DNA连接酶在PCR过程中介导环状质粒的扩增；(2)在小型表达载体中对目标基因或部分目标基因进行原位易错PCR；(3)以不同的筛选标记将随机突变基因与原始模板分离；(4)一套试剂适用于各种目标基因，并且便于对筛选到的正突变基因再次构建突变文库，通过筛选获得多级累加的正突变。试剂盒EvoGen Kit为用该方法构建基因突变文库提供了所需要的各种试剂。

主权项

一种原位构建基因突变文库的方法，（1） 将需要突变的目标基因克隆到表达载体的多克隆位点中构建成重组质粒，并将重组质粒导入大肠杆菌，确认目标基因在大肠杆菌中得到表达；（2）以重组质粒为模板，用选择标记不同于重组质粒的载体片断作引物，加入极耐热性 DNA 连接酶、Taq DNA 聚合酶和PCR缓冲液；（3）在全自动PCR仪中进行易错PCR和连接反应；（4）用PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞，并在与引物所带的选择标记相应的抗性平板上，选择性地培养含突变基因的转化子，获取含正突变基因的重组质粒。