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一种红叶石楠离体叶片体细胞胚诱导快繁培养方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）建立红叶石楠无菌试管苗再生体系：（1.1）选材与材料处理：于春季晴天上午选取生长健壮、性状表现优良的单株，用5%多菌灵喷洒选取的枝条，每周喷洒一次，连续喷洒一个月，之后剪取刚萌发的无病虫嫩枝，包括前端未木质化和半木质化部分，除去多余的茎叶，将需要部分用洗洁精溶液浸泡5‑10min，然后用棉球仔细清洗后，再用流水冲洗1小时，最后用2%NaClO溶液浸泡15‑20min,再用无菌水冲洗干净，用灭菌滤纸吸干水分后备用；（1.2）选材消毒与芽启动萌发培养：将步骤（1.1）所述的处理过的材料置于超净工作台上，用75％的酒精消毒15‑20s，无菌水冲洗5‑6次，再用0．1％升汞灭菌8‑15min，无菌水冲洗6—8次，用灭菌滤纸吸干水分，然后剪取1‑2cm左右带一个腋芽或顶芽的茎段，以生态学下段垂直插入芽启动培养基上，每瓶接种3个外植体，诱导顶芽和腋芽萌发，在培养室温度白天25±2℃ ，夜晚20±2℃，光照强度1500—2000 lx，光照时间14 h／d的条件下，进行15‑20d的培养，茎段腋芽开始萌动，茎尖明显伸长，40‑50d后芽点长成2‑4cm的新梢，形成无菌试管苗；（1.3）无菌试管苗增殖培养：将步骤（1.2）诱导出的无菌试管苗去掉基部叶片，切成含1‑2个腋芽的茎段或茎尖接种在试管苗增殖培养基上，25‑28d后继代1次，通过上述试管苗增殖培养基的NAA浓度在0.1～0.5mgL‑1的可控范围内调整变化，获得大量无菌试管苗，建立起红叶石楠无菌试管苗再生体系；（2）建立离体叶片体胚和不定芽诱导的高频快繁体系：（2.1）诱导体胚和不定芽的形成：以试管苗第3到第6片展开叶为外植体，叶片带短叶柄，将叶片周围带锯齿状叶缘切去，之后做以下处理：一、叶片沿主脉切成左右两半，视叶片大小轻划1‑2刀；二、叶片沿主脉横切2‑3刀，分别接种在第一诱导体胚和/或不定芽形成培养基、第二诱导体胚和/或不定芽形成培养基和第三诱导体胚和/或不定芽形成培养基上，要求外植体叶背朝下紧贴各自的培养基放置，于黑暗培养7‑10d，诱导体胚的形成，于黑暗培养15‑20d，诱导不定芽的形成；（2.2）体胚和不定芽的生长与分化：将第一诱导体胚和/或不定芽形成培养基和第二诱导体胚和/或不定芽形成培养基上培养的外植体转接到第一体胚和/或不定芽生长与分化培养基上，然后放入人工气候箱，温度为10±2℃时，暗培养3‑5d之后转入培养室暗培养35‑40d，或直接在培养室暗培养40‑45d，中间继代一次；而将第三诱导体胚和/或不定芽形成培养基上的外植体转接到第二体胚和/或不定芽生长与分化培养基上，在培养室培养40‑45d，中间继代一次，光照强度1000—1500lx，经过上述第一体胚和/或不定芽生长与分化培养基和第二体胚和/或不定芽生长与分化培养的培养，在外植体上形成许多丛生芽，芽高在2cm～5cm；（2.3）丛生芽增殖快繁培养：将上述步骤（2.2）诱导形成的丛生芽切成含1‑2个腋芽的茎段或茎尖转接到试管苗增殖培养基或第二体胚和/或不定芽生长与分化培养基上交替继代，进行增殖快繁培养，每18‑22d继代一次，增殖频率为10‑15；（3）试管苗生根炼苗移栽：（3.1）壮苗生根培养：将上述步骤（2.3）生长发育健壮的长到3‑4cm后的丛生芽切成单株转接到壮苗生根培养基上，培养25‑35d，保证茎叶发育正常，根系生长健壮，根长至1.5cm以上时，进行炼苗移栽；（3.2）炼苗移栽：首先将试管苗瓶盖打开，在培养室适应1d后移到遮光度70‑80%的遮荫网塑料大棚,在温室条件下炼苗2‑3d，用镊子将苗夹出，清水洗去基部残留的培养基，移栽到装有混合育苗基质的穴盘中，利用间歇喷雾装置或人工喷水保持相对湿度在80%以上，经驯化炼苗5‑10d后，在新根新芽萌出后，逐渐减少浇水次数并移栽到花盆进行常规管理；所述的芽启动培养基为：改良MS + 0.5～1.0 mgL‑1BA + 0.5～1.0mgL‑1KT + 0.1～0.2mgL‑1NAA + 6.0～7.0gL‑1琼脂 + 30gL‑1蔗糖, 且pH值为5.8～6.0；所述的试管苗增殖培养基为：改良MS + 1.0～2.0mgL‑1BA + 1.0～2.0mgL‑1KT + 0.1～0.5mgL‑1NAA + 6.0～7.0gL‑1琼脂 + 30gL‑1蔗糖, 且pH值为5.8～6.0；所述的第一诱导体胚和/或不定芽形成培养基为：改良MS + 0.5mgL‑12,4‑D + 0.5～1.0mgL‑1BA + 0.5～2.0mgL‑1NAA + 3.0～3.5gL‑1phytagel + 20gL‑1蔗糖, 且pH值为5.8～6.0；所述的第二诱导体胚和/或不定芽形成培养基为：改良MS + 0.1mgL‑12,4‑D + 0.5mgL‑1BA + 10～30 mgL‑1NAA + 3.0～3.5gL‑1phytagel + 20gL‑1蔗糖, 且pH值为5.8～6.0；所述的第三诱导体胚和/或不定芽形成培养基为：改良MS + 2.0～4.0mgL‑1 NAA + 0.2～0.5mgL‑12,4‑D + 0.5～2.0mgL‑1BA+ 0.5～2.0 mgL‑1KT+ 6.0～7.0gL‑1琼脂 + 30gL‑1蔗糖, 且pH值为5.8～6.0；所述的第一体胚和/或不定芽生长与分化培养基为：改良MS + 2.0～4.0mg L‑1BA + 3.0～3.5gL‑1phytagel + 20gL‑1蔗糖,且pH值为5.8～6.0；所述的第二体胚和/或不定芽生长与分化培养基为：改良MS + 2.0mgL‑1 BA + 1.0 mgL‑1 IBA + 2.0 mgL‑1 KT + 6.0～7.0gL‑1琼脂 + 30gL‑1蔗糖, 且pH值为5.8～6.0；所述的壮苗生根培养基为：1/2改良MS + 0.2～0.5mgL‑1 IBA + 0～0.05mgL‑1NAA + 6.0～7.0gL‑1琼脂 + 20gL‑1蔗糖, 且pH值为5.8～6.0。 |
