用于骨代谢生化标志物检测的液相芯片及其制备方法

摘要

本发明公开了一种用于多项骨代谢生化标志物并行检测的液相芯片试剂盒，主要包括有：包被微球；分别用生物素标记的检测抗体；和链亲和素藻红蛋白。本发明所提供的多项骨代谢生化标志物并行检测液相芯片具有检测效率高，所需样本量少，特异性强，灵敏度高等优点。同时，各项骨代谢生化标志物可自由组合，使用方便。同时，由于所有反应均处在液相环境，更有利于保持蛋白质的天然构象，使探针和被检测物的反应更快更完全，因此检测灵敏度和线性范围均得到极大的提高。

主权项

一种制备用于多项骨代谢生化标志物并行检测的液相芯片的方法，主要包括以下步骤：(1)相应的捕获抗体包被微球：‑将50μL微球活化后，≥8000g，离心；‑吸弃上清，将微球重悬于pH5.0的230‑280μL 50mM的MES的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s，后将微球于≥8000g，离心1‑2min；重复该步骤；‑吸弃上清，将微球重悬于100μL 50mM pH5.0的MES的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s；‑往悬浮的微球中加入相应的0.8‑1.2μg捕获抗体，用50mM的pH5.0的MES溶液将总体积补至450‑550μL；‑用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5‑2.5hr；‑偶联了抗体后的微球以≥8000g的速度，离心1‑2min；‑吸弃上清，将微球重悬于500μL PBS‑TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声振荡约20s；‑室温避光振荡30min；再于≥8000g，离心1‑2min；‑吸弃上清，将微球重悬于1mL PBS‑TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s；微球≥8000g，离心1‑2min；重复该步骤一次；‑吸弃上清，将微球重悬于500‑1000μL PBS‑TBN溶液中；‑每种包被好的微球通过luminex仪器计数后置于2‑8℃避光单独保存，使用时，依据检测需要等比例混合；得到含有分别包被了骨碱性磷酸酶的捕获抗体的微球、包被了骨钙素捕获抗体的微球、包被了I型前胶原N‑端前肽捕获抗体的微球、I型前胶原C‑端前肽捕获抗体的微球，包被了血浆抗酒石酸酸性磷酸酶捕获抗体的微球、包被了I型胶原交联C‑端肽捕获抗体的微球，和/或者含有包被了尿胶原吡啶啉捕获抗体的微球、包被尿胶原脱氧吡啶啉捕获抗体的微球以及包被了I型胶原交联N‑端肽捕获抗体的微球，上述微球分别具有不同颜色编码；(2)每种检测抗体的生物素标记：‑依据检测抗体浓度计算出检测抗体溶液稀释至1mg/ml的体积，视为目标体积；‑配置10mg/ml的NHS‑Biotin反应液；‑按摩尔比1∶100于反应管中分别加入检测抗体与NHS‑Biotin反应液； ‑加入体积为目标体积的1/10的pH8.9的NaHCO3溶液；‑加入pH7.4的PBS补至目标体积；‑包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25℃恒温箱中避光孵育3‑5小时，转速为800rpm‑1000rpm；‑将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS‑Biotin；得到分别用生物素标记的骨碱性磷酸酶、骨钙素、I型前胶原N‑端前肽、I型前胶原C‑端前肽、血浆抗酒石酸酸性磷酸酶、I型胶原交联C‑端肽的检测抗体；和/或分别用生物素标记的尿胶原吡啶啉、尿胶原脱氧吡啶啉以及I型胶原交联N‑端肽的检测抗体；‑使用时根据需要将标记好的每种检测抗体等比例混合。