人乳头瘤病毒的酵母增殖模型及建立方法与应用

摘要

本发明公开了一种人乳头瘤病毒的酵母增殖模型及制备方法，是含有酵母营养缺陷筛选标记Ura3的HPV基因组的酿酒酵母细胞Y303ATCC No.96659或酿酒酵母细胞YPH500ATCC No.76626。本发明所述模型可用于研究HPV基因的功能，或者使用酵母RNA干扰技术研究不同基因的功能，或者再次导入酵母表达载体，在细胞中表达感兴趣的外源蛋白，以研究其在病毒生活周期的作用，或者导入病毒主要衣壳蛋白L1表达载体，包装感染性病毒颗粒，用于实验或HPV疫苗研究。

主权项

一种人乳头瘤病毒的酵母增殖模型的建立方法，步骤包括设计构建带筛选标记的HPV58基因组，转化酿酒酵母细胞，酿酒酵母细胞中HPV58基因组的功能鉴定，其特征在于，所述HPV58基因组的构建方法是，将酵母营养缺陷筛选标记Ura3插入质粒pEGFPN1‑HPV58的L2基因中构建pEGFPN1‑HPV58‑Ura；酶切pEGFPN1‑HPV58‑Ura释放HPV58‑Ura；所述转化酿酒酵母细胞的方法是，将释放的HPV58‑Ura用连接酶环化，环化反应体系为：T4 DNA连接酶1μl、10x连接缓冲液2μl、线性HPV58‑Ura 200‑500ng、用蒸馏水补足20μl，置于16℃，30‑60分钟；之后按常规酵母转化条件转化酿酒酵母细胞Y303 ATCCNo.96659；所述酿酒酵母细胞中HPV58基因组的功能鉴定的方法是，采用如下方法实施酵母细胞破壁：①在Lyticase酶解消化后加入改良的裂解buffer‑I进行破壁；或②在改良的裂解buffer‑II中加入酸洗玻璃珠，再加入实验量酚、氯仿或trizol，振荡10分钟破壁；提取阳性克隆酵母细胞的Hirts DNA、酵母染色体DNA和酵母质粒，用荧光定量PCR和基于RNA探针的Southern blot鉴定HPV58‑Ura在酵母细胞中的存在形式；荧光定量PCR鉴定HPV58基因组能否在酵母细胞中稳定复制传代；反转录PCR以及实时荧光定量PCR鉴定酵母细胞中HPV58早期和晚期mRNA的表达；其中：上述buffer‑I配方为10mM Tris‑HCl，pH 7.5，10mM EDTA，和0.2％ TritonX‑100；buffer‑II配方为10mM Tris‑HCl，pH8.0，1mM EDTA，1％ SDS和2％ Triton X‑100。