壳寡糖脂肪酸嫁接物键合阿霉素药物及制备与应用

摘要

本发明提供壳寡糖脂肪酸嫁接物键合阿霉素前体药物，将盐酸阿霉素溶于二甲基亚砜，加三乙胺搅拌，产物溶于吡啶；另将顺乌头酸酐溶于二氧己烷，滴加到阿霉素溶液中，搅拌，萃取，离心，沉淀物分散于水中，冷冻干燥，得阿霉素-顺乌头酸中间体；将壳寡糖脂肪酸嫁接物溶于水，另取霉素-顺乌头酸中间体加入二甲基亚砜溶液，滴加到嫁接物水溶液中，搅拌，透析，冷冻干燥即得，其中壳寡糖分子量1～200kDa，脱乙酰度为70％-100％，脂肪酸的碳链长度C12-C22，氨基取代度1％～50％。阿霉素与壳寡糖脂肪酸嫁接物化学键合后，具有显著的抗肿瘤治疗活性，并可逆转肿瘤细胞的耐药性，可在逆制备抗肿瘤和逆转肿瘤细胞耐药性药物中应用。

主权项

一种壳寡糖脂肪酸嫁接物键合阿霉素前体药物的制备方法，其特征在于通过以下步骤实现：(1)低分子量壳聚糖的制备取市售分子量为450kDa、脱乙酰度为95％的壳聚糖50g，加至1500mL体积比1.2％的盐酸水溶液中，55℃条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶涨后，缓慢加入重量比为2％的壳聚糖酶溶液，在55℃温度条件下进行壳聚糖酶解反应，以凝胶渗透色谱法控制壳聚糖的降解程度，待反应结束后，在80℃下搅拌0.5h，加入重量/体积比0.3％的活性炭，将反应液稀释后，用布氏漏斗过滤，滤液用0.45μm微孔滤膜处理，喷雾干燥得壳寡糖，所得壳寡糖的重均分子量为18.1kDa；(2)壳寡糖硬脂酸嫁接物的合成取上述壳寡糖800mg，加30ml蒸馏水超声溶解，另分别称取253mg的硬脂酸和1.0g的碳二亚胺SA 204.2mg，硬脂酸与碳二亚胺的摩尔比为1∶10，混合，加入20ml乙醇，水浴超声溶解，于60℃下搅拌40min，然后缓慢注射到壳寡糖水溶液中，壳寡糖与硬脂酸的摩尔比为1∶20，80℃下搅拌反应4h，冷却至室温，将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析3天，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳寡糖硬脂酸嫁接物；采用三硝基苯磺酸法测定壳寡糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度，取1～10mg不同重量的壳寡糖分别溶于2ml的蒸馏水，加入4％碳酸氢钠2ml和0.1％三硝基苯磺酸2mL，37℃下孵育2h，加入2mol/L盐酸2mL，摇匀，344nm处测定吸光度，制备标准曲线，取上述壳寡糖‑硬脂酸4mg溶于2mL蒸馏水中，同法操作，按标准曲线计算壳寡糖‑硬脂酸嫁接物的氨基取代度为6.47％；(3)阿霉素碱制备：称取盐酸阿霉素200mg，溶于20ml二甲基亚砜中，加入三乙胺，盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1∶2，搅拌过夜，将反应液置透析袋中，蒸馏水透析24小时，冷冻干燥，得到阿霉素碱；(4)阿霉素‑顺乌头酸中间体制备：称取上述阿霉素碱50mg，溶于2ml吡啶中，另称取阿霉素与顺乌头酸酐的摩尔比为1∶5的顺乌头酸酐，溶于5ml二氧己烷中，缓慢滴加到阿霉素溶液中，低温下搅拌过夜，用25ml氯仿和25ml5％NaHCO3萃取，取水层，重复两次，用盐酸调节pH至3，有沉淀析出，继续搅拌30min，10000rpm低温离心分离10min，弃去上清液，加入少量蒸馏水，离心，弃去上清液，得到的沉淀产物分散于水中，冷冻干燥，得到阿霉素‑顺乌头酸中间体；(5)目的物制备：称取壳寡糖的脱乙酰度为95％、重均分子量为18.1kDa、脂肪酸为C18、硬脂酸的氨基取代度为6.47％的壳寡糖脂肪酸嫁接物100mg，溶于200ml水中，探头超声30次，另称取1mg、5mg、20mg或50mg的阿霉素‑顺乌头酸中间体，加入二甲基亚砜溶液，使中间体浓度为1mg/ml，中间体溶液缓慢滴加到嫁接物水溶液中，加入过量碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺，中间体与碳二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺摩尔比为1∶10∶10，室温下搅拌过夜，将反应液置透析袋中，二甲基亚砜水混合溶媒透析2天，蒸馏水继续透析1天，冷冻干燥，得到寡糖脂肪酸嫁接物键合阿霉素前体药物。