利用基因工程菌株耦合发酵合成人乳岩藻糖基化寡糖的方法

摘要

本发明涉及了一种利用基因工程菌株耦合发酵合成人乳岩藻糖基化寡糖的方法，主要是利用基因工程技术构建代谢工程菌株实现代谢途径中关键酶的高效表达，进而在体外实现人乳岩藻糖基化寡糖的生物合成，此方法构建的工程菌株能增加这种酶基因的拷贝数，提高酶的表达量从而能高效合成人乳岩藻糖基化寡糖，为工业化低价合成人乳低聚糖提供一条可行途径，不仅具有较强的基础理论研究价值，而且具有较大的经济效益和社会效益，市场开发前景广阔。

主权项

一种利用基因工程菌株耦合发酵合成人乳岩藻糖基化寡糖的方法，其特征在于：包括以下几个步骤：(1)基因扩增：根据大肠杆菌E.coli K12中己糖激酶glk、磷酸甘露糖变位酶manB、甘露糖‑1磷酸鸟苷转移酶manC、GDP‑甘露糖4，6‑脱水酶gmd、GDP‑4‑酮‑6‑脱氧甘露糖3，5‑变旋酶/4‑还原酶wcaG和幽门螺旋杆菌Helicobacter pylori HPAG1中α‑1，2岩藻糖基转移酶基因fuct的序列设计引物，以大肠杆菌E.coli‑K12和HPAG1染色体DNA为模板分别对上述目的基因进行PCR扩增，扩增得到的相应的目的基因；(2)重组质粒的构建：用酶切连接的方法将扩增得到的相应的目的基因与载体pET‑22b相连，得到携带目的基因的重组表达载体pET‑glk‑manB‑manC，pET‑gmd‑wcaG和pET‑fuct，并进行双酶切验证；(3)基因工程菌株的构建：将上述验证正确的重组表达载体pET‑glk‑manB‑manC，pET‑gmd‑wcaG和pET‑fuct分别转化到宿主菌株BL21(DE3)中，得到含有重组质粒的基因工程菌株BL21(DE3)/pET‑glk‑manB‑manC、B2：BL21(DE3)/pET‑gmd‑wcaG和B3：BL21(DE3)/pET‑fuct；(4)耦合发酵合成人乳岩藻糖基化糖：将步骤(3)得到的三株基因工程菌株于培养基中混合发酵，以甘露糖为合成底物，合成人乳岩藻糖基化寡糖。