一种提取棉花的线粒体DNA的方法

摘要

本发明公开了一种提取棉花的线粒体DNA的方法。本发明的方法包括如下步骤：(1)棉花匀浆，离心收集沉淀；(2)去除核DNA，加EDTA溶液，离心得沉淀；(3)加缓冲液，离心得线粒体；(4)加裂解液，再加乙酸盐溶液，离心收集上清，用氯仿-异戊醇抽提；(5)加乙酸盐溶液，再加无水乙醇，离心得沉淀，用乙醇洗涤；(6)用TE溶解；(7)去除RNA和蛋白，用Tris饱和酚-氯仿-异戊醇抽提，离心收集上清；(8)加乙酸盐溶液，再加乙醇，离心得沉淀；用乙醇洗涤，得线粒体DNA。本发明针对目前提取线粒体DNA中存在的不足，改进传统的CTAB法，调整离心的时间和次数、更改试剂、增加抽提洗涤次数等，优化提取条件。本发明确保对线粒体机械损伤程度最小的基础上，有效的除去线粒体以外的核DNA以及酚类、多糖类物质，降低污染率，提高线粒体DNA的纯度和质量，可以满足棉花线粒体基因工程后续实验。

主权项

一种提取棉花的线粒体DNA的方法，包括线粒体的提取和线粒体DNA的提取两个步骤；所述线粒体的提取包括如下步骤(1)至步骤(3)：(1)将棉花样品在缓冲液A中进行匀浆，离心收集沉淀；所述缓冲液A的制备方法如下：将0.05mol Tris‑HCl、1.2mol NaCl、2mmol EDTA、6‑10g聚乙烯吡咯烷酮、2‑5mmolβ‑疏基乙醇和0.1‑0.8g BSA用水定容至1升，调pH值至7.5‑8.5；(2)向步骤(1)的沉淀加入缓冲液B和DNase I，以去除核DNA，然后加入EDTA水溶液或EDTA‑Na2水溶液，离心得到沉淀；所述缓冲液B的制备方法如下：将0.05mol Tris‑HCl、0.1‑0.5mol蔗糖、0.01‑0.05mol MgCl2和1‑5g聚乙烯吡咯烷酮用水定容至1升，调pH值至7.5‑8.5；(3)向步骤(2)的沉淀加入缓冲液C和缓冲液D，离心得到线粒体；所述缓冲液C的制备方法如下：将0.05mol Tris‑HCl、0.02mol EDTA‑Na2和0.1‑0.5mol蔗糖用水定容至1升，调pH值至7.5；所述缓冲液D的制备方法如下：将0.05mol Tris‑HCl、0.02mol EDTA‑Na2和0.2‑1.0mol蔗糖用水定容至1升，调pH值至7.5‑8.5；所述线粒体DNA的提取包括如下步骤(4)至步骤(8)：(4)向步骤(3)的线粒体加入裂解液进行裂解，然后加入乙酸盐水溶液，离心收集上清液，用等体积的溶液甲进行抽提，离心得到沉淀；所述溶液甲由氯仿和异戊醇组成，氯仿和异戊醇的体积比为24∶1；(5)向步骤(4)的沉淀加入乙酸盐水溶液，再加入无水乙醇，离心得到沉淀，用70％(体积百分含量)乙醇水溶液洗涤沉淀；(6)用TE溶液或T50E10溶液溶解步骤(5)的沉淀；(7)然后加入RNaes，以去除RNA；然后加入蛋白酶K，以去除蛋白；然后用等体积的溶液乙进行抽提，离心收集上清液；所述溶液乙由Tris饱和酚、氯仿和异戊醇组成，Tris饱和酚、氯仿和异戊醇的体积比为25∶24∶1；(8)向步骤(7)的上清液加入乙酸盐水溶液，再加入无水乙醇，离心得到沉淀；用70％(体积百分含量)乙醇水溶液洗涤沉淀，得到棉花的线粒体DNA。