葡萄病程相关蛋白PR10-1水解RNA与抑菌活性的方法

摘要

本发明公开了一种葡萄病程相关蛋白PR10-1水解RNA与抑菌活性的方法，根据野生葡萄病程相关蛋白基因480bp开放阅读框构建突变体K55N、E149G、Y151H，将PR10-1基因，分别插入原核表达载体pGEX-4T-1中，使其与GST标签处于同一读码框，PR10-1及其突变体融合蛋白与烟草赤星病菌的培养结果表明，PR10-1与Y151H对烟草赤星病菌的抑制效果比突变体K55N及E149G融合蛋白显著的多，这也是由于K55N及E149G中RNA酶活性有关的保守氨基酸残基被突变其RNA酶活性被降低所致。本发明所通过对所克隆的葡萄病程相关蛋白PR10-1体外RNA酶活性与抑菌活性的检测，快速验证出此葡萄病程相关基因PR10-1具有很强的抗病功能，这将加速筛选葡萄重要抗病基因资源。

主权项

葡萄病程相关蛋白PR10‑1水解RNA与抑菌活性的方法，其特征在于：根据中国野生葡萄病程相关蛋白基因480bp开放阅读框构建突变体K55N、E149G、Y151H，将PR10‑1基因及其突变体K55N、E149G、Y151H四个基因，分别插入原核表达载体pGEX‑4T‑1中，使其与GST标签处于同一读码框，将构建好各重组质粒导入大肠杆菌BL21中，在BL21中经IPTG诱导表达出融合蛋白，通过超声破碎法从BL21细胞中分离并纯化出PR10‑1和突变体融合表达蛋白，将纯化好的融合蛋白加入到酵母tRNA液中，以煮沸变形的融合蛋白为阴性对照，以来源于大肠杆菌RNase为阳性对照，检测各融合蛋白的RNA酶活性，将加入不同量的融合蛋白到PDA培养基培养的烟草赤星病菌中，黑暗培养5天后观测赤星病病菌生长情况，用无菌去离子水从培养基表面洗下病菌后，在紫外分光光度计595nm测定病菌孢子悬浮液OD值，量化融合蛋白对赤星病菌生长的抑制。