一种用于检测赤潮藻种类和数量的检测方法

摘要

本发明公开了一种用于检测赤潮藻种类和数量的检测方法，其中，包括联吡啶钌标记寡核苷酸探针的步骤、构建标准曲线的步骤和样品检测的步骤，具体为：将联吡啶钌标记探针(Bio-NPA-Ru)与目标藻细胞中的rRNA进行杂交反应，经核酸S1酶酶切后去除掉不匹配或游离的Bio-NPA-Ru探针；剩余的杂交复合体变性后，带有生物素标记的Bio-NPA-Ru探针与链霉亲和素包被的磁珠相结合，磁珠被工作电极下面的磁极吸附于电极表面，缓冲液去除多余成分后，加入三丙胺溶液液，在电极加压的情况下启动电致化学发光反应。从而建立定量关系实现对目标藻的定量检测。本发明灵敏度高，重现性好，连续可测，操作简便，易于控制，分析时间短。

主权项

一种用于检测赤潮藻种类和数量的检测方法，其特征在于，包括构建标准曲线的步骤和样品检测的步骤，其中，所述构建标准曲线的步骤进一步包括如下步骤：a、选择一种赤潮藻藻种‑微小原甲藻；微小原甲藻细胞收集与裂解：收集已知细胞浓度的藻细胞于2ml离心管中，12000rpm离心5分钟，弃去上清；在收集管中加入1ml裂解杂交液，用超声波细胞破碎仪在450瓦特功率、50％占空比周期下超声波破碎4分钟，真空过滤收集细胞裂解液，按梯度进行稀释；b、Bio‑NPA‑Ru探针与细胞裂解液中的rRNA杂交：分别吸取细胞裂解液，加入Bio‑NPA‑Ru探针使其终浓度为50nM，加入100μl液体石蜡后95℃处理15分钟，然后于42℃杂交2小时；c、核酸S1酶酶解消化反应：待杂交液自然冷却后加入相同体积的含有核酸S1酶和核糖核酸酶A的S1酶酶切缓冲液，核酸S1酶和核糖核酸酶A在缓冲液中的浓度分别为2U/μl和0.1mg/ml，于42℃处理1小时；d、中止消化反应并变性溶液中的DNA/RNA杂交体：加入5倍体积的S1酶中止缓冲液，95℃处理15分钟，自然冷却后用于电致化学发光分析；e、移取上步反应得到的全部溶液与5μl浓度为1mg/ml的包被有链霉亲和素的磁珠于离心管中，37℃震荡孵育1小时；f、在外加磁极的情况下将混合液吸出，用50ul的磷酸盐缓冲液洗2次，然后用磷酸盐缓冲液稀释到400ul；g、将上述液体与200ul三丙胺溶液混合，在ECL反应池中检测发光信号；以铂片为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极构建电化学发光反应样品池，工作电极与参比电极之间的恒电位由外置的恒电位仪给定，在1.0V电压和1.0mA电流下进行电化学反应，检测发光信号强度，以光纤将光子信号连接至光子计数探头，计算机记录检测信号，建立光信号值，即得到细胞数量标准曲线，得到回归方程。