维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法

摘要

本发明属于大肠癌肿瘤细胞原代培养技术领域。包括：1)手术获取新鲜肿瘤标本，清洗并剪去污秽及坏死区域，碘伏浸泡消毒，采用含双抗的PBS清洗液清洗；2)将上述肿瘤标本剪成细小组织块，静置、去上清液，之后再用含双抗的PBS清洗液清洗，离心分离，去上清液；3)采用胶原酶消化法或组织块贴壁法，在培养液中进行组织贴壁及细胞爬出；4)在上述培养液中继续培养并纯化处理，维持细胞生长至所需数量。常规原代培养方法培养良好状态的大肠癌肿瘤细胞，成功率很低(6％)，本发明所述的原代培养方法可达33％以上，显著提高了原代大肠癌细胞短期体外培养成功的概率，且工艺简单易行，成本低，为应用短期生长原代大肠癌细胞的实验研究提供了一个可供选择的良好平台。

主权项

一种维持大肠癌肿瘤细胞短期生长的原代培养方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1)从手术室获取新鲜状态肿瘤标本，生理盐水清洗并剪去污秽及坏死区域后，碘伏浸泡消毒5分钟，采用含双抗的PBS清洗液清洗；2)在含双抗的PBS清洗液中将上述肿瘤标本剪成细小组织块，静置、去上清液，之后再用含双抗的PBS清洗液清洗，离心分离，去上清液；3)采用胶原酶消化法或组织块贴壁法，在培养液中进行组织贴壁及细胞爬出，所述的培养液为10‑20％胎牛血清培养液；4)在上述培养液中继续培养并纯化处理，维持细胞生长至所需数量；所述的胶原酶消化法工艺步骤为：a.根据标本组织块量，按1∶8‑12的体积比加入胶原酶消化液，置于37℃水浴摇箱中作用0.5‑3小时，至组织块均呈半毛絮状或细小颗粒状，静置，滴管吸弃上清液；b.离心分离，用滴管吸弃上清液，然后使用无血清DMEM培养液重悬、吹洗混匀，离心，弃上清液；c.在10‑20％胎牛血清培养液中以薄量液体培养方式培养48小时后，弃去原培养液，换入足量新培养液，并每3日换一次培养液；所述的组织块贴壁法工艺步骤为：a.经处理后的标本组织加入无血清DMEM培养液重悬、清洗，离心分离，弃上清液；b.根据标本组织块量，按1∶8‑12的体积比加入胶原酶消化液，置于37℃水浴摇箱中作用20‑40分钟，使组织块表面间质分离，暴露肿瘤细胞，之后用无血清DEME培养液清洗，静置沉淀、弃上清液；c.加入纯胎牛血清(FBS)，混匀，使标本组织充分浸润；d.组织块的种植：将纯胎牛血清(FBS)浸泡的组织块吸至培养瓶或培养皿内，分布均匀，继续滴加纯胎牛血清(FBS)至完全覆盖培养瓶或培养皿底面，将培养瓶或培养皿缓慢倾斜状态放置入培养箱内，使组织块黏附贴壁；e.6‑12小时后，加入10‑20％胎牛血清培养液，使组织块刚好被浸没而不至于浮起，重新水平位放入培养箱内培养，根据组织块的多少每隔24‑48小时换一次培养液。至组织块贴壁牢固后，加入足量培养液每72小时换液一次；上述胶原酶消化液为含胶原酶1mg/ml和透明质酸酶0.5mg/ml的混合液，过滤无菌后溶于DMEM培养液中。