一种微囊藻毒素-LR单抗免疫亲和柱的制备和使用方法

摘要

一种微囊藻毒素-LR(MC-LR)单抗免疫亲和柱(IAC)的制备和使用方法，属于免疫亲和层析及微囊藻毒素(MC)检测技术领域。本发明所研制的IAC是将MC-LR单抗固定于柱中，通过蓝藻样品的溶剂提取、固相萃取(SPE)柱富集、IAC净化，然后进液质联用仪进行定量测定，能得到MC-LR和MC-RR含量的准确结果。只用SPE净化，不用IAC净化，杂质会对测定产生严重干扰，而影响测定结果的准确性。本发明建立的方法能应用于水样、其它藻类及类似的生物样品中MC的检测。

主权项

一种微囊藻毒素‑LR单抗免疫亲和柱的制备方法，其特征是：(1)用水溶性碳二亚胺法制备微囊藻毒素‑LR与牛血清白蛋白BSA偶联物，以下简称MC‑LR‑BSA，微囊藻毒素‑LR简称MC‑LR，用MC‑LR‑BSA作为免疫原，用混合酸酐法制备MC‑LR与载体蛋白OVA的偶联物，以下简称MC‑LR‑OVA，用MC‑LR‑OVA作为检测抗原，通过免疫方法获得MC‑LR单抗；(2)琼脂糖凝胶Sepharose 4B的活化：用溴化氰法活化琼脂糖凝胶Sepharose 4B，活化过程如下：(a)取10mL Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，用30mL水分两次洗涤后抽干，加少量的0.1mol/L pH8.3的NaHCO3洗涤，立即转入100mL烧杯中，冰浴下缓慢搅拌；(b)在通风橱内称取1g溴化氰，加水10mL溶解，然后分批加入Sepharose4B中，边加边搅拌，同时测pH值，通过滴加2mol/L NaOH，使pH保持在10.5，待溴化氰反应完全，pH保持不变，停止搅拌；(c)将活化的Sepharose 4B加入小冰块，迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以150mL冷的0.1mol/L pH8.3的NaHCO3抽洗；(3)MC‑LR单抗免疫亲和柱的制备：将MC‑LR单抗与琼脂糖凝胶Sepharose 4B偶联得到的亲和吸附剂，填充入柱中得到MC‑LR单抗免疫亲和柱，简称IAC，操作步骤如下：(d)偶联将制备纯化好的MC‑LR单抗置于pH8.3含有0.5mol/L NaCl的0.1mol/LNaHCO3的偶联缓冲液中透析12h；将上述活化好的Sepharose 4B置于砂芯漏斗中用偶联缓冲液快速抽洗，然后迅速倒入MC‑LR单抗溶液中进行偶联，紫外扫描监控偶联过程；用5倍MC‑LR单抗溶液体积以上的偶联缓冲液洗去未偶联的MC‑LR单抗，得到琼脂糖‑抗体偶联复合物；收集全部的洗脱液，通过测定其蛋白质的含量计算未偶联上MC‑LR单抗的量；(e)封闭活性基团将琼脂糖‑抗体偶联复合物转入5倍体积pH8.0的含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L Tris‑HCl缓冲液中，保持2h，以封闭Sepharose 4B中多余的活性基团；(f)洗涤步骤(e)得到的琼脂糖‑抗体偶联复合物依次用5倍偶联复合物体积的pH4.0的含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L醋酸缓冲液和5倍偶联复合物体积的pH8.0的含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L Tris‑HCl缓冲液洗涤，此洗涤过程重复三次；然后用5倍偶联复合物体积的PBS洗涤两次；(g)防腐处理步骤(f)制备好的琼脂糖‑抗体偶联复合物如需放置一段时间，应使用含有1/10000叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，然后沥去多余的溶液后放入包装袋或瓶中在4℃密闭保存；(h)装柱将步骤(f)或(g)得到的琼脂糖‑抗体偶联复合物填充入2mL或5mL固相萃取空柱管中，在负压下用PBS将凝胶压紧，即制成MC‑LR单抗IAC；(i)保存琼脂糖‑抗体偶联复合物或填充好的MC‑LR单抗IAC切勿冷冻，保存在4℃的冰箱内；(j)IAC的再生IAC使用后，用4‑10个柱床体积pH8.5含0.5mol/L NaCl的0.1mol/LTris‑HCl缓冲液，和用4‑10个柱床体积pH4.5含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L醋酸钠缓冲液轮流清洗IAC两次，再用PBS缓冲液充分平衡IAC后保存在4℃冰箱内供下次使用。