一种利用海洋链霉菌发酵制备溶菌酶的方法

摘要

本发明涉及一种利用海洋链霉菌发酵制备溶菌酶的方法。目前溶菌酶主要从蛋清中提取，产量有限。本发明方法首先将海洋链霉菌菌种接种于固体培养基中进行恒温培养，将种子液菌种接种于液体培养基中进行培养，制成种子液；然后将种子液进行放大发酵获得发酵液；将发酵液通过陶瓷膜微滤法除去菌体，滤液通过超滤浓缩截流分子量10～30kDa之间的组分，获得浓缩液，将浓缩液层析纯化并进行洗脱，洗脱液冷冻干燥后获得溶菌酶产品。本发明方法制备的溶菌酶具有安全、广谱、高效等特性。在饲料加工、食品工业、畜牧业、水产养殖等领域有广泛应用前景。本发明方法显著缩短了浓缩时间和生产周期，降低了能耗和生产成本，适合于产业化生产。

主权项

一种利用海洋链霉菌发酵制备溶菌酶的方法，其特征在于该方法具体步骤为：步骤(1)发酵菌种的准备：取保存在液氮罐中的海洋链霉菌菌种接种于固体培养基中，在28～30℃条件下培养96～120小时，选取单菌落作为种子液菌种；固体培养基的配置方法是：首先配置基液，基液中各组分的重量含量为(NH4)2SO41～2％、甘油2～4％、酵母粉0.1～0.5％、NaCl 3～4％、MgSO4，0.01～0.05％、KH2PO40～0.5％、KNO30～0.2％、FeSO4.7H2O 0.01～0.1％、CuSO40.002～0.01％、琼脂粉2～3％，余量为人工海水；然后用NaOH或HCl将基液的pH值调至6.5～7.0，最后在115～121℃条件下灭菌15～20分钟，冷却至常温，得到固体培养基；步骤(2)制备海洋链霉菌的种子液：将种子液菌种接种于置于容器中的液体培养基中进行培养，种子液菌种与液体培养基的重量比为1～3∶100，容器置于转速为140～200转/分钟的摇床中，在28～30℃条件下培养36～48小时，培养至对数生长期，制成细菌浓度为108～109cfu/L的种子液；液体培养基的配置方法是：首先配置基液，基液中各组分的重量含量为(NH4)2SO41～2％、甘油2～4％、酵母粉0.1～0.5％、NaCl 3～4％、MgSO4，0.01～0.05％、KH2PO40～0.5％、KNO30～0.2％、FeSO4.7H2O 0.01～0.1％、CuSO40.002～0.01％、余量为人工海水；然后用NaOH或HCl将基液的pH值调至6.5～7.0，最后在115～121℃条件下灭菌15～20分钟得到液体培养基；步骤(3)将种子液进行放大发酵：取上述种子液接种置于发酵罐中的发酵培养基中，种子液菌种与发酵培养基的重量比为1～3∶100，发酵罐中搅拌器的转速为140～200转/分钟，在28～30℃条件下培养60～72小时，培养至对数生长期，发酵液中的细菌浓度为108～109cfu/L；发酵培养基的配置方法与液体培养基的配置方法相同；步骤(4)发酵液中溶菌酶的分离纯化：将发酵液通过陶瓷膜微滤法除去菌体，滤液通过超滤浓缩截流分子量10～30kDa之间的组分，去除色素、杂蛋白和无机盐，获得浓缩液；将浓缩液置于Sephedex G‑50层析柱中，再用pH值为6.5～7.0、摩尔浓度为0.1～0.5M的Na2HPO4‑NaH2PO4缓冲液以0.1～0.3ml/min的流速对层析柱进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥后获得溶菌酶产品。