猪圆环病毒Ⅱ型-猪肺炎支原体表达菌株的构建及应用

摘要

本发明涉及猪圆环病毒II型-猪肺炎支原体表达菌株的构建及应用，属于生物技术领域。本发明方法构建的表达猪圆环病毒II型-猪肺炎支原体主要抗原蛋白的原核表达工程菌株，该菌株能够同时表达猪肺炎支原体的主要抗原蛋白R1蛋白及猪圆环病毒的主要抗原蛋白CAP蛋白，纯化得到的重组蛋白能够刺激机体产生抵抗猪圆环病毒II型及猪肺炎支原体攻击的保护性免疫反应，能够有效的防止猪圆环病毒及猪肺炎支原体的感染。

主权项

猪圆环病毒II型(PCV2)‑猪肺炎支原体(Mhp)表达菌株的构建方法，其特征在于步骤如下：(1)PCV2CAP基因和Mhp R1基因的扩增及克隆分别以PCV2和Mhp毒株提取的DNA为模板，用特异性引物，PCR扩增，得PCV2的CAP蛋白的核酸片段及猪肺炎支原体的主要抗原决定区R1的核酸片段，其大小分别为718bp和246bp，然后将得到的克隆片段CAP及R1分别克隆到克隆载体pMD‑18‑T上，得到克隆载体pMD‑18‑T‑CAP和pMD‑18‑T‑R1；(2)含有PCV2CAP基因和Mhp R1基因的原核表达载体的构建通过限制性内切酶将克隆片段CAP及R1分别连接到原核表达载体pET‑28a(+)中，得到原核表达质粒pET‑28a(+)‑R1‑CAP；(3)含有原核表达质粒pET‑28a(+)‑R1‑CAP的表达菌株的获得通过转化的方法将原核表达质粒pET‑28a(+)‑R1‑CAP通过热击转化方法转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，然后通过卡那霉素抗性筛选的方法得到阳性克隆菌株，后小量提取质粒进行双酶切鉴定，最后进行测序鉴定，得到阳性原核表达菌株。