应用多重PCR鉴定鸡胚盘性别的方法

摘要

本发明属于动物繁殖技术领域，具体地，本发明属于一种家禽性别鉴定技术领域，具体涉及一种多重PCR鉴定鸡胚盘性别的方法。其步骤包括：1)根据GenBank登录号为D85614的鸡EE0.6序列设计两对嵌套式引物，并根据GenBank登录号为NC_006089鸡wisp1基因设计两对嵌套式引物作为内部对照；2)提取已知性别的鸡血样基因组DNA，进行引物特异性检验，然后提取待测的鸡胚盘细胞DNA进行PCR扩增，根据扩增的DNA片段大小鉴定鸡胚盘性别，当扩增的DNA片段为500bp的一条带即判定该胚胎为雄性，当扩增的DNA片段为500bp和246bp的两条带则判定该胚胎为雌性。本发明还公开了扩增所用的引物的序列。

主权项

一种多重PCR鉴定鸡早期胚盘性别的应用方法，其步骤如下：1)根据GenBank登录号为D85614的鸡EE0.6基因的核苷酸序列设计两对嵌套式引物，并根据GenBank登录号为NC_006089鸡wisp1基因的核苷酸序列设计两对嵌套式引物作为内部对照引物；2)提取已知性别的鸡血样基因组DNA，进行引物特异性检验，然后提取待测的鸡胚盘细胞DNA进行PCR扩增，根据扩增的DNA片段大小鉴定鸡胚盘性别；其中，雄性为一条500bp的带，雌性为500bp和246bp两条带；扩增EE0.6基因和Wisp1基因所用引物的核苷酸序列如下：EE0.6基因外引物正向：5’CAGTTATGGTCCTATGCCTAC 3’；               反向：5’GTAATGGGTTCAGGTTGAGTC 3’；内引物正向：5’CCTATGCCTACCACATTCCTAT 3’；      反向：5’GTTGGCACTGATTTAGTTCCTT 3’；对照序列Wisp1基因外引物正向：5’GTCAAAATGTCCCCTCCTGT 3’；                       反向：5’CTGGGCACTCAAACCTCAC 3’；内引物正向：5’GGGTTCATTGGCCCTGTA 3’；      反向：5’CCCCTCCTGTGCTTTCAC 3’；巢氏PCR反应条件和扩增程序如下：第一轮反应体系为20μL：2μl的10×buffer，2μl的Mg2+，内部对照外引物正向引物、内部对照外引物反向引物、EE0.6外引物正向引物、EE0.6外引物反向引物各1μl，0.4μl的Tag酶，0.4μl的d NTP，3μl模板DNA，补充ddH2O至20μl；外引物的第一轮扩增程序是：94℃10min，94℃30s，60℃45s，然后72℃45s，从第二步至第四步循环25次，最后72℃延伸10min；第二轮反应体系为20μL：2μl的10×buffer，2μl的Mg2+，内部对照内引物正向引物、内部对照内引物反向引物、EE0.6内引物正向引物、EE0.6内引物反向引物各1μl，0.4μl的Tag酶，0.4μl的d NTP，0.5μl的第一轮PCR扩增产物，补充ddH2O至20μl；内引物的第二轮扩增程序是94℃5min，94℃30s，56℃45s，然后72℃45s，从第二步至第四步循环35次，最后72℃延伸10min。