一种快速检测空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药突变点的荧光定量PCR方法

摘要

本发明属生物技术领域，涉及一种检测空肠弯曲杆菌大环内酯类药物耐药相关基因突变的方法。本发明利用实时荧光定量PCRTaqMan探针技术，依据空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药突变区23S rDNA中V区的核酸序列，设计特异性的引物和探针，通过优化TaqMan实时荧光定量PCR反应体系和反应条件，以准确检测靶基因的相关耐药突变点。本发明能够快速准确地同时检测出空肠弯曲杆菌大环内酯类耐药的两个主要突变位点，比目前已经报道的相关分子生物学检测方法具有更好的特异性和更高的灵敏度，比传统的测序和药敏实验方法操作简便、准确快速。本发明为耐大环内酯类空肠弯曲杆菌分子流行病学监测提供了有力的技术手段。

主权项

一种快速检测空肠弯曲杆菌大环内酯类药物耐药突变点的荧光定量PCR方法，其特征在于利用特异性TaqMan探针，同时检测空肠弯曲杆菌23S rDNA中的2074位和2075位的基因突变，它包括下述步骤：a、根据空肠弯曲杆菌大环内酯耐药突变位点的靶基因序列设计、合成引物和荧光探针；b、将引物、荧光探针与反应试剂配比、组合，构成实时荧光定量PCR反应体系；c、优化实时荧光定量PCR的反应条件，其中退火温度为58℃至64℃；d、进行实时荧光定量PCR反应，鉴别人工构建的野生型和突变型对照质粒；e、进行实时荧光定量PCR反应，鉴别空肠弯曲杆菌耐药相关基因的突变情况；其中：步骤a中所述的空肠弯曲杆菌大环内酯耐药性突变位点的靶基因序列位于一对引物之间，序列长度为147bp，该基因的核苷酸序列如下：CGAGATGGGAGCTGTCTCAAAGAGGGATCCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAGCTTGACACTGCTACTTGGATAAGAATGTGCAGGATAGGTGGG；步骤a中所述的引物对的核苷酸序列如下：引物1：5’CGA GAT GGG AGC TGT CTC AAA G 3’，引物2：5’CCC ACC TAT CCT GCA CAT TCT T 3’；步骤a中所述的荧光探针为TaqMan探针，其探针5’端为FAM或HEX荧光基团标记，3’端标记荧光淬灭集团TAMRA，所述的荧光探针的序列为：探针WT：(FAM)‑TCCACGGGGTCTTTCCGTCTTG‑(TAMRA)，探针A2074C：(HEX)‑TCCACGGGGTCTTGCCGTCTT‑(TAMRA)，探针A2075G：(HEX)‑TCCACGGGGTCTCTCCGTCTTG‑(TAMRA)。