利用酵母表达系统生产DSPAα1的方法

摘要

本发明公开了一种利用毕赤酵母表达系统生产DSPAαl的方法，步骤包括(1)合成DSPAαl基因的核苷酸序列或按照毕赤酵母偏好密码子序列优化DSPAαl基因的核苷酸序列；(2)双酶切合成的或优化的DSPAαl基因序列，构建重组表达质粒X-DSPAαl；(3)转化毕赤酵母菌株细胞及平板筛选阳性转化子；(4)毕赤酵母重组菌株发酵筛选；(5)由毕赤酵母重组菌株表达上清液中分离纯化DSPAαl。本发明的方法成本低、周期短、技术上容易实现，摇瓶发酵表达量达到75mg/L，初步达到工业化生产水平，并且分离纯化后的DSPAαl最终纯度大于97％以上，可以直接用于制剂的研究和制备。

主权项

一种利用毕赤酵母表达系统生产DSPAα1的方法，步骤包括(1)按照毕赤酵母偏好密码子序列优化DSPAα1基因的核苷酸序列；(2)双酶切优化的DSPAα1基因序列，构建重组表达质粒X‑DSPAα1；(3)转化毕赤酵母菌株细胞及平板筛选阳性转化子；(4)毕赤酵母重组菌株发酵筛选；(5)由毕赤酵母重组菌株表达上清液中分离纯化DSPAα1；其特征是：步骤(1)中优化的DSPAα1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；步骤(2)所述的重组表达质粒X‑DSPAα1为pPIC9K‑DSPAα1；步骤(3)所述转化毕赤酵母菌株细胞的方法采用电击转化或化学转化，所述的毕赤酵母菌株为GS115；步骤(4)所述毕赤酵母重组菌株发酵筛选的培养基为BMGY/BMMY；步骤(5)所述分离纯化DSPAα1的步骤为：15℃～25℃温度条件下，先将毕赤酵母重组菌株表达上清液用截留分子量10KDa的超滤器超滤，使其浓缩到符合阳离子交换层析柱上样条件，然后将其加样到用平衡缓冲液平衡的阳离子交换层析柱上进行洗脱，去除杂蛋白和非蛋白杂质，再利用凝胶过滤层析柱进行上样洗脱，去除二聚体和小分子杂质，洗脱中出现唯一的洗脱峰，即为纯化DSPAα1产物，其中所述阳离子交换层析柱为CM sepharose FF层析柱，所述凝胶过滤层析柱为Sephadex G‑75层析柱，所述平衡缓冲液选自pH5.0‑8.0的磷酸盐缓冲液或Na2HPO4‑柠檬酸缓冲液。