一个与耐旱相关的水稻WRKY基因的克隆及应用

摘要

本发明所提供了一种来源于水稻的与耐旱性相关的WRKY蛋白及其编码基因，将该基因或与之同源的编码相同功能蛋白的DNA序列导入植物组织、细胞或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到耐旱性提高的转基因植物。实验证明，将本发明的基因转化水稻可显著提高水稻对干旱胁迫的耐受性，且对水稻的正常生长和经济性状没有明显的影响。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐旱机制的研究，以及提高植物的耐旱性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物(特别是禾谷类作物)的耐旱基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

主权项

一种提高植物耐旱性的方法，是将耐旱性相关的WRKY基因通过植物表达载体导入水稻组织，再将被转化的水稻组织培育成植株，得到耐旱性提高的转基因水稻，所述耐旱性相关的WRKY基因编码氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：1蛋白质，其中用于构建所述植物表达载体的出发载体是一种可用于根瘤农杆菌转化植物的双元载体，而且所述导入水稻组织的步骤为：挑取转化有SEQ ID NO：1蛋白质的阳性重组农杆菌的单菌落接种于含壮观霉素50mg/L和利福平50mg/L的20mLYEB液体培养基中，在28℃、150rpm下振荡培养2‑3天，再于4℃、5000rpm离心3分钟，去上清，将菌体沉淀重悬于含0.1mmol/L乙酰丁香酮的AA培养基中，在28℃下避光振荡培养1‑2小时至OD600＝0.6‑0.9；挑选按常规植物组织培养方法获得的水稻中花11的生长状态良好、颗粒状愈伤组织浸入上述转化有SEQ ID NO：1蛋白质的重组农杆菌培养液中摇动20分钟后，静置30分钟，取出，用无菌滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织接种于N6共培养基上培养；2‑3天后，将愈伤组织放入广口瓶中，用无菌水冲洗3‑5次，每次摇动数次，直到水中不见丝状菌体，然后在含500mg/L头孢霉素的无菌水中浸泡30‑60分钟，最后再用无菌水冲洗1遍，置于无菌滤纸上凉干，最后转入N6共培养基中共培养，其中，AA培养基含Co(NO3)2·6H2O 0.15mg/L，CaCl2 110mg/L，MgSO4 122mg/L，KI 3.75mg/L，NaH2PO4·H2O150mg/L，Na2‑EDTA 0.01mM，FeSO4·7H2O 139mg/L，KCl 2.95g/L，MnSO4·4H2O 84.5mg/L，ZnSO4·7H2O 6.25mg/L，H3BO35mg/L，Gly 37.5mg/L，CuSO40.005mg/L，Na2MoO4·2H2O1.25mg/L，盐酸硫胺素VB15mg/L，烟酸5mg/L，盐酸吡哆醇VB65mg/L，肌酸0.1g/L，酪蛋白水解物0.3g/L，L‑Gln 87.6mg/L，L‑Asp 26.6mg/L，和蔗糖20g/L；N6共培养基的配方为：(NH4)2SO40.46g/L，KNO32.83g/L，CaCl20.2g/L，MgSO40.092g/L，KH2PO40.4g/L，Na2‑EDTA 0.15g/L，FeSO4·7H2O 0.11g/L，MnSO4·4H2O0.44g/L，ZnSO4·7H2O 0.17g/L，H3BO30.14g/L，CoCl2·6H2O 0.0005g/L，CuSO4·5H2O0.0005g/L，Na2MoO4·2H2O 0.005g/L，盐酸硫胺素VB10.01g/L，烟酸0.001g/L，盐酸吡哆醇VB60.001g/L，肌酸0.1g/L，酪蛋白水解物0.3g/L，L‑Pro 0.5g/L，蔗糖30g/L，琼脂10g/L，10g/L葡萄糖，1mg/L乙酰丁香酮，2，4‑二氯苯氧乙酸(2，4‑D)2mg/L，以及pH5.8。