柔嫩艾美耳球虫蛋白质二硫键异构酶基因的克隆、表达及应用

摘要

本发明公开了一种柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)蛋白质二硫键异构酶基因EtPDI(克隆号：BW1-E06，Genbank登录号EF552214)，本发明将该基因连接到原核表达载体pGEX-4T-2，构建了原核表达重组质粒pGEX-4T-EtPDI，并在大肠杆菌系统中进行了表达，表达的重组蛋白大部分以可溶性形式存在。通过纯化重组蛋白4T-EtPDI进行SPS-PAGE，再转移至PVDF膜上，用E.tenella卵囊口服免疫鸡的抗血清作为-抗，羊抗鸡IgG作为二抗进行Western-blot分析，表明它有一定的抗原性。能用于制备抗鸡球虫病药物和抗鸡球虫病疫苗。

主权项

一种柔嫩艾美耳球虫蛋白质二硫键异构酶基因EtPDI的克隆和表达方法，其特征在于该方法包括下列步骤：(1)试剂与材料Trizol、GeneRaceTM Kit；TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit、限制性内切酶；pGEM‑T‑easyvector；DEPC、X‑Gal、Tag Plus I DNA聚合酶；bacto‑yeast extract、Agar A、bacto‑tryptone；丙烯酰胺、N，N‘‑亚甲基甲叉双丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵；HRP‑羊抗兔IgG3；HRP‑羊抗鸡IgG；蛋白质预染Marker；High‑Affinity GST Resin；罗曼优质黄羽鸡；柔嫩艾美耳球虫E.tenella；pGEX‑4T‑2表达载体、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21DE3；(2)方法①RACE引物的合成：利用抑制性消减杂交技术和cDNA微阵列技术筛选柔嫩艾美耳球虫E.tenella孢子发育阶段的未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子虫体差异表达基因，获得了孢子化卵囊、子孢子阶段虫体高表达基因BW1‑E06、根据其EST序列，设计了3’和5’RACE引物：3’Primer            5’‑ACACCACGTTGCCATTTGAGTCCTT‑3’3’Nested Primer     5’‑CCTCCGGGAACAGAATTAGGTCCAT‑3’5’Primer            5’‑TCAGATGGGACTGGAGAAACACGAA‑3’5’Nested Primer     5’‑CTTGTGCGTCGTGAAGGCTAAGT‑3’②RACE产物的扩增：进行RACE产物的扩增，扩增获得的RACE产物克隆到pGEM‑T‑easy载体中，挑选阳性克隆，进行测序，根据测序结果查找3′、5′RACE产物序列与原EST序列的重叠部分，将三段序列拼接；③含ORF全长基因的克隆：根据拼接的cDNA序列设计上下游引物，进行含ORF cDNA片断的PCR扩增；上游引物：5’‑TCACAATCTAATTCCCTTTTCACT‑3’下游引物：5’‑CATTTTTGACGGATTTCGTTT‑3’以3’RACE和5’RACE扩增时mRNA反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，反应条件94℃2.0min；94℃30s，52℃40s，72℃2.0min，30个循环，72℃10min；扩增获得的PCR产物经纯化后与pGEM‑T‑easy Vector连接，构建的重组pGEM‑T‑EtPDI转化JM109感受态细胞，进行兰白斑筛选，挑选白斑菌落过夜培养后，进行PCR鉴定，鉴定正确的单菌落测序；④生物信息学分析：利用在线软件ORF finder分析获得的新基因的全长cDNA序列，找出编码框；ProtParam工具计算编码蛋白质的理论分子量、等电点、氨基酸组成；Antigenic程序分析其抗原位点；利用Singal P3.0在线分析软件分析编码蛋白有无信号肽；ProtScale在线分析软件分析编码蛋白的疏水性；利用TMHMM服务器分析编码蛋白有无跨膜结构；BLASTp软件以及FASTA软件用于同源蛋白的搜索；利用CDD软件查询NCBI保守区的功能域数据库，查询有无保守功能域；利用motif_scan分析功能结构域；⑤荧光实时定量RT‑PCR：选择18SrRNA看家基因作为内参，标准化反应结果；提取柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子的总RNA，去除基因组DNA后，利用随机引物反转录成cDNA第一链，EtPDI基因定量PCR的引物为：Sense Primer：5′‑CAGCGGACAAGGACGAAAG‑3′，Antisense Primer：5′‑GTCAGAGCCAACAACTACCAAG‑3′；18S rRNA的引物为Sense Primer：5′‑GAGTATGGTCGCAAGGCTGA‑3′，Antisense Primer 5′‑CAGGCTAAGGTCTCGTTCGTT‑3′反应体系如下：成分                                    体积μL5×RT‑PCR Buffer                            5.0Mg2+250mmoL/L                               0.3dNTP 10mmoL/L                               0.75上游引物10μmoL/L                           0.5下游引物10μmoL/L                           0.525×EvaGreen                                1.0HS‑Ex‑Taq 5U/μL                            0.25模板                                        2.0ddH2O                                       14.7Total volume                                25.0反应程序：95℃90s；95℃5s，58℃30s，80℃10s 40个循环，其中80℃10s结束时间点为荧光信号检测点；制作溶解曲线的程序为：95℃1min；58℃1min；58℃10s 80个循环，每个循环温度升高0.5℃；采用BIO‑RAD公司iCyclerTM IQ version 5.0软件进行计算分析，得出相对于每百万持家基因的目的基因含量；⑥重组表达质粒的构建：将经鉴定正确的重组质粒pGEM‑T‑EtPDI，利用克隆载体pGEM‑T‑easy和表达载体pGEX‑4T‑2的多克隆位点，选择合适的酶Bam H I和EcoR I进行双酶切，酶切后回收EtPDI和pGEX‑4T‑2片段，连接构建重组表达质粒：pGEX‑4T‑EtPDI，连接后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，进行阳性克隆的鉴定，对筛选的阳性克隆提取质粒后转化大肠杆菌BL21⑦重组表达质粒pGEX‑4T‑EtPDI在大肠杆菌中的表达：将鉴定好的pGEX‑4T‑EtPDI/BL21(DE3)转化菌接种于液体LB含氨苄青霉素培养基，37℃震荡培养过夜，将培养过夜的菌液按1％的比例接种到另一LB含氨苄青霉素液体培养基中，37℃，200r/min，振荡培养2h‑3h，使细菌生长至对数生长期，OD600＝0.6‑1.0时，加入终浓度为1mmoL/L的IPTG诱导表达，在加入IPTG诱导后0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h分别收集菌体，应用SDS‑PAGE分析菌体蛋白，确定最佳诱导时间；⑧重组蛋白的分离纯化：根据确定的最佳诱导时间，将重组质粒4T‑EtPDI转化大肠杆菌BL21后，加入终浓度为1mmoL/L IPTG，于37℃摇床振荡培养，诱导重组蛋白的表达，当表达量达到高峰时，离心，收集菌体，确定重组表达蛋白以可溶形式存在，还是以包涵体形式存在，利用GST Resin纯化重组表达蛋白；⑨Western‑blot检测重组表达蛋白：将纯化的重组蛋白进行SDS‑PAGE电泳后转移至聚偏二氟乙烯膜上，用柔嫩艾美耳球虫卵囊口服免疫鸡的抗血清经pGEX‑4T‑2/BL21大肠杆菌裂解液吸附处理后作为一抗，辣根过氧化酶标记的羊抗鸡IgG为二抗进行Western‑blot检测分析。