基于G₄DNA酶显色的可视化基因检测试剂的制备方法

摘要

本发明涉及一种基于G4DNA酶显色的可视化猪瘟病毒基因检测试剂的制备方法，包括选取病毒感染后的细胞，经冻融裂解后，采用基因提取试剂盒提取目标基因，经逆转录、灭活MMLV逆转录酶后得到cDNA；将cDNA加入不对称PCR体系，经变性、退火及延伸扩增50-100个循环得到不对称PCR产物；将上、下游探针和不对称PCR产物加入到G4DNA酶显色反应缓冲液中，经变性、退火后再加入Hemin、ATBS和H2O2进行显色反应，观察有无肉眼可见的绿色出现，可判定有无猪瘟病毒感染。本发明检测速度快、精确稳定、重现性好、检测步骤简单、操作简便、可肉眼直接观察显色反应，结果直观、成本低廉。

主权项

基于G4DNA酶显色的可视化基因检测试剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：A、目标基因的提取选取经猪瘟病毒感染后的PK‑15细胞，经‑70℃冻融3次，每次10‑30分钟后，取200μl加RNA裂解液1ml混匀，室温静置10‑15分钟，加0.2ml氯仿，再室温静置3‑5分钟，于4℃ 12000g/min离心10‑15分钟，上清液转移到另一个离心管，加0.5ml异丙醇，室温沉淀10‑20分钟，再于4℃ 12000g/min离心10分钟，轻轻倒出上清，加1ml 75%乙醇于4℃ 7500g/min离心5分钟，弃上清，RNA沉淀在室温下自然晾干，加DEPC处理过的水20μl得到目标基因RNA；B、cDNA的制备采用基因提取试剂盒取步骤A所得到的目标基因RNA 10μl，加入反向引物 W3（‑）1μl（20µmol/L）和dNTPs  1μl（10µmol/L），65℃孵育5分钟，再迅速置冰上5分钟，然后加逆转录反应缓冲液4μl（5×buffer），RNA酶抑制剂1μl，DTT 2µl（0.1mol/L），MMLV逆转录酶1μl，于42℃反应50分钟、75℃反应10分钟，即得到cDNA；C、不对称PCR的扩增取步骤B制好的cDNA 5μl，加入到100μl的不对称PCR体系中进行反应，循环条件为：95℃预变性2分钟；94℃变性15 秒，53℃退火 15秒，72℃延伸15秒，扩增50‑100个循环；最后72℃延伸10分钟，得到PCR产物； D、G4DNA酶显色反应分别取G4DNA酶显色反应缓冲液20μl，上游探针Prob1L 2μl（20μmol/L）和下游探针Prob1R 2μl（20µmol/L），加无菌双蒸水补足为91μl，加入至D步骤所得的含有100μl不对称PCR反应液的200μl PCR管中，95℃变性5 min；30℃退火3min，加入Hemin底物0.5μl（50mmmol/L），放置5min，再加入8μl（50 mmol/L） ATBS和0.5μl （1 mol/L）H2O2显色，观察有无肉眼可见的绿色出现。