一种新型高效小鼠胰腺单细胞悬液的制备方法

摘要

本发明公开了一种新型、高效的分离制备小鼠胰腺单细胞悬液的方法，包括小鼠胰腺取材、胰酶冷消化、胰腺单细胞分离与纯化等步骤。本发明的技术关键是利用胰酶在低温低活力状况下浸入胰腺组织，然后再通过短时温消化解离胰腺组织，从而获得高数量、高纯度、高活力、无粘连的胰腺单细胞悬液。与常规胰腺细胞分离方法相比，该发明具有操作稳定、细胞得率高、细胞活性高等特点，避免了常规胰腺分离方法中胰酶长时间温孵育对胰腺细胞造成伤害、细胞大量死亡释放出DNA缠绕造成细胞粘连等缺点，解决了胰腺单细胞分离和分析困难问题，为进一步利用胰腺细胞奠定基础。

主权项

一种小鼠胰腺单细胞悬液的制备方法，其特征在于：通过胰酶冷消化法分离小鼠胰腺、制备单细胞悬液的技术方法，步骤如下：(1)胰酶冷消化：于培养皿中加入4℃预冷的0.25％胰蛋白酶消化液，体积以没过组织为准，4℃冷孵育14‑18小时；(2)胰腺单细胞的分离：从4℃取出培养皿，去除上层消化液，加入37℃预热的DMEM培养基以及0.1mg/mL的Dnase I，37℃消化10min后，采用吸打‑沉降法分离胰腺组织，经8‑12次吸打‑沉降，收集上层的单细胞悬液；向剩余未消化胰腺组织中加入0.8mg/mL胶原酶IV进行第2次消化，酶量以没过组织为准，37℃消化10分钟，然后经2‑3次吸打‑沉降，收集上层的单细胞悬液；(3)胰腺单细胞悬液的制备：对两次收集的单细胞悬液离心，转速为800～1000 rpm/min，离心5分钟后弃去上清液、上层的组织细胞碎片、DNA絮状缠绕物，以及中间层的血细胞，保留最下层乳白色的胰腺实质细胞层，用小体积PBS缓冲液重悬细胞，即得到了制备好的胰腺单细胞悬液。