用质谱技术进行HPV定量的方法

摘要

本发明提供了一种分型和定量样品中的HPV的新方法，其包括以下步骤：设计HPV型别特异性突变质粒和野生质粒；构建数学模型以确定HPV型别特异性突变质粒与野生型质粒的浓度比例与质谱峰图中相应的峰面积比值的相关性；对样品中的HPV进行分型和定量。本发明还提供了用于该方法的试剂盒。

主权项

用于对样品中的HPV进行分型和定量的方法，其包括以下步骤：(1)构建多个HPV型别的每一个型别的野生质粒和突变质粒，其中各HPV型别的野生质粒分别包含第一DNA片段，所述第一DNA片段能够用于进行针对该型别的特异性扩增；各HPV型别的突变质粒分别包含第二DNA片段，所述第二DNA片段与相同型别的野生质粒的第一DNA片段仅在延伸碱基所对应的位点上相异；(2)将不同浓度的各HPV型别的野生质粒与突变质粒混合，并进行质谱检测法，获得质谱峰图，从而确定各个HPV型别的野生质粒和突变质粒的浓度比与质谱峰图中各自的延伸产物峰的峰面积比值的相关性；(3)将待检测的样品与确定浓度的步骤(1)中构建的各突变质粒混合，并进行质谱检测法，获得质谱峰图；任选地，在进行步骤(3)之前，对待检测的样品进行稀释；(4)根据步骤(3)获得的质谱峰图确定所述样品的延伸产物峰的分子量大小，从而对样品中的HPV进行分型；(5)在确定样品中的HPV型别后，测定样品的延伸产物峰与相应HPV型别的突变质粒的延伸产物峰的峰面积比值，从而根据步骤(2)获得的相关性确定样品中的HPV的浓度，对样品中的HPV进行定量；其中，优选所述样品是宫颈脱落细胞，优选待分型和定量的HPV是HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68中的一种或几种；其中，优选所述质谱检测法包括以下步骤：1)用扩增引物PCR扩增DNA，从而获得扩增产物；2)任选地，除去步骤1)的扩增产物中的dNTP，优选通过使用SAP酶处理所述扩增产物来除去dNTP；3)以步骤1)或2)中获得的产物为模板，用延伸引物通过单碱基延伸反应获得延伸产物；4)任选地，纯化所述延伸产物，优选通过树脂来进行纯化，从而获得纯化产物；和5)用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统对步骤3)或4)的产物进行检测；进一步优选，所述扩增引物的核苷酸序列分别如缺失5′端前10个碱基的SEQ ID NO：1‑21所示，优选所述扩增引物在5′端还包含标签序列，更优选各扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1‑21所示；优选所述延伸引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：22‑36所示；优选各HPV型别的突变质粒的所述延伸碱基分别如表2所示。