一种抗凝溶栓双功能融合蛋白的凝胶层析复性方法

摘要

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种抗凝溶栓双功能融合蛋白即水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白包涵体的凝胶层析复性方法。该方法特征在于：先将变性蛋白进行一定时间氧化复性，然后采用Superdex75进行层析复性。层析复性时先在Superdex75柱内预设一段变性剂浓度梯度，融合蛋白在变性剂浓度梯度降低的过程中恢复其空间构象。同时在缓冲液中添加氧化还原体系和分子伴侣辅助蛋白构象转变。该法得到的双功能融合蛋白经过一定处理后复性效果更好。该法的优点在于：操作简单，易于放大，复性后蛋白浓度较高，复性率较高。

主权项

一种抗凝溶栓双功能融合蛋白的凝胶层析复性方法，其特征在于以水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的包涵体为原料，变性溶解后得到融合蛋白的变性溶液，变性蛋白先在氧化复性缓冲液中进行氧化复性，然后在具有脲浓度梯度的层析介质为Superdex G75的凝胶层析柱中进行层析复性，其中：所说的水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的氨基酸序列为MASDFEPIPEDAYDEGGGSYQGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGHSWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP；所说的变性溶解包涵体的缓冲溶液组成为20‑50mmol/L Tris‑HCl、6‑8mol/L脲或3‑7mol/L胍，含0.5‑1mmol/L DTT或1％‑1.5％(v/v)β‑巯基乙醇，pH8.5，变性温度为37℃‑40℃，变性时间为6‑8h；所说的氧化复性缓冲液组成为20‑50mmol/L Tris‑HCl，6‑8mol/L尿素或3‑7mol/L胍，0.05‑0.1mol/L GSSG、0.5‑0.9mol/L L‑Arg，pH 9.0‑9.5，氧化复性温度为25℃，时间为6‑12h；所说的在凝胶层析柱中进行层析复性的柱平衡及洗脱所用的缓冲液为20‑50mmol/LTris‑HCl，0.5‑0.7mol/L L‑Arg，0.5‑1.5mol/L Urea，1‑10mmol/L GSH，1‑10mmol/L GSSG，1mmol/L EDTA，pH 8.5。